Mikroskop çözünürlük formülü. Mikroskop büyütme. Mikroskop çözünürlüğü

Mikroskop, küçük nesneleri büyütecin sağladığından daha büyük büyütme ve daha yüksek çözünürlükle gözlemlemek için tasarlanmıştır. Mikroskobun optik sistemi iki parçadan oluşur: mercek ve mercek. Mikroskop merceği, göz merceğinin ön odak düzlemindeki nesnenin gerçek büyütülmüş ters görüntüsünü oluşturur. Mercek bir büyüteç görevi görür ve en iyi görüş mesafesinde sanal bir görüntü oluşturur. Mikroskopun tamamına göre söz konusu nesne ön odak düzleminde yer alır.

Mikroskop Büyütme

Bir mikro merceğin hareketi doğrusal büyütme ile karakterize edilir: V ob = -Δ/F\" ob * F\" ob - mikro merceğin odak uzaklığı * Δ - merceğin arka odağı ile merceğin ön odağı arasındaki mesafe mercek, tüpün optik aralığı veya optik uzunluğu olarak adlandırılır.

Göz merceğinin ön odak düzleminde mikroskop objektifi tarafından oluşturulan görüntü, görünür büyütme özelliğine sahip bir büyüteç görevi gören göz merceği aracılığıyla izlenir:

Tamam =¼ F tamam

Bir mikroskobun genel büyütmesi, objektif büyütme ile göz merceği büyütmesinin çarpımı olarak belirlenir: G=V yaklaşık *G yaklaşık

Mikroskobun tamamının odak uzaklığı biliniyorsa, görünen büyütme oranı, büyüteçle aynı şekilde belirlenebilir:

Kural olarak, modern mikroskop merceklerinin büyütülmesi standartlaştırılmıştır ve bir dizi sayıya karşılık gelir: 10, 20, 40, 60, 90, 100 katı. Göz merceği büyütmelerinin de çok spesifik değerleri vardır; örneğin 10, 20, 30 kat. Tüm modern mikroskoplar, farklı büyütme oranları elde etmek üzere birleştirilebilecek şekilde özel olarak tasarlanmış ve birbirine uyacak şekilde üretilmiş bir dizi objektife ve göz merceğine sahiptir.

Mikroskobun görüş alanı

Mikroskopun görüş alanı göz merceğinin açısal alanına bağlıdır ω oldukça iyi kalitede bir görüntü elde edilir: 2y=500*tg(ω)/G * G - mikroskop büyütme

Göz merceğinin belirli bir açısal alanı için, mikroskobun nesne uzayındaki doğrusal alanı, görünür büyütmesi ne kadar büyükse o kadar küçüktür.

Mikroskop çıkış gözbebeği çapı

Bir mikroskobun çıkış gözbebeği çapı şu şekilde hesaplanır:
burada A mikroskobun ön açıklığıdır.

Mikroskobun çıkış gözbebeğinin çapı genellikle gözbebeğinin çapından (0,5 - 1 mm) biraz daha küçüktür.

Mikroskopla gözlem yaparken, gözün gözbebeği mikroskobun çıkış gözbebeğiyle aynı hizada olmalıdır.

Mikroskop çözünürlüğü

Mikroskobun en önemli özelliklerinden biri çözünürlüğüdür. Abbe'nin kırınım teorisine göre, bir mikroskobun doğrusal çözünürlük sınırı, yani bir nesne üzerinde ayrı olarak görüntülenen noktalar arasındaki minimum mesafe, mikroskobun dalga boyuna ve sayısal açıklığına bağlıdır:
Bir optik mikroskobun elde edilebilecek maksimum çözünürlüğü, mikroskop açıklığı ifadesine dayanarak hesaplanabilir. Açının sinüsünün mümkün olan maksimum değerinin birlik olduğunu hesaba katarsak, ortalama dalga boyu için mikroskobun çözünürlüğünü hesaplayabiliriz:

Mikroskobun çözünürlüğünü arttırmanın iki yolu vardır: * Objektif açıklığını artırarak, * Işığın dalga boyunu azaltarak.

Daldırma

Merceğin açıklığını arttırmak için, söz konusu nesne ile mercek arasındaki boşluk, daldırma indisi birden büyük olan şeffaf bir madde olan daldırma sıvısı adı verilen bir maddeyle doldurulur. Sıvı olarak su, sedir yağı, gliserin çözeltisi ve diğer maddeler kullanılır. Yüksek büyütmeli daldırma hedeflerinin açıklıkları değerine ulaştığında, bir daldırma optik mikroskobunun elde edilebilecek maksimum çözünürlüğü olacaktır.

Ultraviyole ışınlarının uygulanması

Mikroskobun çözünürlüğünü arttırmak için ikinci yöntemde, dalga boyu görünür ışınlarınkinden daha kısa olan ultraviyole ışınları kullanılır. Bu durumda ultraviyole ışığa karşı şeffaf olan özel optiklerin kullanılması gerekir. İnsan gözü ultraviyole radyasyonu algılamadığından, ya görünmez ultraviyole görüntüyü görünür hale dönüştürecek araçlara başvurmak ya da görüntüyü ultraviyole ışınlarda fotoğraflamak gerekir. Dalga boyunda mikroskobun çözünürlüğü olacaktır.

Ultraviyole ışık gözlem yönteminin artan çözünürlüğün yanı sıra başka avantajları da vardır. Tipik olarak canlı nesneler spektrumun görünür bölgesinde şeffaftır ve bu nedenle gözlemden önce önceden boyanır. Ancak bazı nesneler (nükleik asitler, proteinler), spektrumun ultraviyole bölgesinde seçici absorpsiyona sahiptir, bu nedenle ultraviyole ışıkta lekelenmeden "görünür" olabilirler.

2. Mikroskobun optik sistemi.

3. Mikroskop büyütme.

4. Çözünürlük sınırı. Mikroskobun çözünürlük gücü.

5. Yararlı mikroskop büyütme.

6. Özel mikroskopi teknikleri.

7. Temel kavramlar ve formüller.

8. Görevler.

Gözün bir nesnenin küçük ayrıntılarını ayırt edebilme yeteneği, retinadaki görüntünün boyutuna veya görüş açısına bağlıdır. Görüş açısını arttırmak için özel optik cihazlar kullanılır.

25.1. Büyüteç

Görüş açısını arttırmak için en basit optik cihaz, kısa odaklı yakınsak bir mercek olan (f = 1-10 cm) bir büyüteçtir.

Söz konusu nesne büyüteç ile ön kısmı arasına yerleştirilir odak sanal görüntüsü belirli bir göz için uyum sınırları dahilinde olacak şekilde. Genellikle uzak veya yakın konaklama uçakları kullanılır. İkinci durum tercih edilir, çünkü göz yorulmaz (halka şeklindeki kas gergin değildir).

Bir nesnenin "çıplak" bakıldığında görülebildiği görüş açılarını karşılaştıralım normal gözle ve büyüteçle. Bir nesnenin sanal görüntüsünün sonsuzda (uzaklaştırma sınırı) elde edildiği duruma yönelik hesaplamaları yapacağız.

Bir nesneyi çıplak gözle görüntülerken (Şekil 25.1, a), maksimum görüş açısını elde etmek için nesnenin en iyi görüş mesafesine a 0 yerleştirilmesi gerekir. Nesnenin görüldüğü görüş açısı β = B/a 0'a eşittir (B, nesnenin boyutudur).

Bir nesneyi büyüteçle görüntülerken (Şekil 25.1, b), büyütecin ön odak düzlemine yerleştirilir. Bu durumda göz, sonsuz uzaklıktaki bir düzlemde bulunan B" nesnesinin hayali bir görüntüsünü görür. Görüntünün görülebildiği görüş açısı β" ≈ B/f'ye eşittir.

Pirinç. 25.1. Bakış açıları: A- çıplak gözle; B- bir büyüteç kullanarak: f - büyütecin odak uzaklığı; N - gözün düğüm noktası

Büyüteç- görüş açısı oranıβ", altında bir nesnenin görüntüsünü büyüteçte, görüş açısına göre görebileceğinizβ, altında bir nesnenin en iyi görüş mesafesinden "çıplak" normal gözle görülebildiği yer:

En iyi görme mesafeleri farklı olduğundan, yakın görüşlü ve uzak görüşlü gözler için büyütme büyütmeleri farklıdır.

Yakın görüşlü veya uzak görüşlü bir gözün uzak uyum düzleminde bir görüntü oluştururken kullandığı büyütücünün verdiği büyütmenin formülünü türetmeden sunalım:

burada mesafe konaklamanın uzak sınırıdır.

Formül (25.1), büyütecin odak uzaklığını azaltarak isteğe bağlı olarak büyük bir büyütme elde edebileceğinizi önerir. Prensip olarak bu doğrudur. Bununla birlikte, bir büyütecin odak uzaklığı azaltıldığında ve boyutu aynı kaldığında, büyütmenin tüm etkisini ortadan kaldıran sapmalar ortaya çıkar. Bu nedenle tek lensli büyüteçler genellikle 5-7x büyütmeye sahiptir.

Sapmaları azaltmak için iki veya üç mercekten oluşan karmaşık büyüteçler yapılır. Bu durumda 50 kat artış elde etmek mümkün.

25.2. Mikroskop optik sistemi

Bir nesnenin başka bir mercek veya mercek sistemi tarafından oluşturulan gerçek görüntüsü bir büyüteçle görüntülenerek daha fazla büyütme elde edilebilir. Böyle bir optik cihaz mikroskopta uygulanır. Bu durumda büyüteç denir mercek, ve diğer mercek - lens. Işınların mikroskopta izlediği yol Şekil 2'de gösterilmektedir. 25.2.

Nesne B, merceğin ön odağının yakınına (F yaklaşık), gerçek, büyütülmüş görüntüsü B", göz merceği ile ön odağı arasında yer alacak şekilde yerleştirilir.

Pirinç. 25.2. Mikroskopta ışınların yolu.

Bu durumda göz merceği, gözle görülen hayali büyütülmüş bir B" görüntüsünü verir.

Nesne ile mercek arasındaki mesafeyi değiştirerek B" görüntüsünün gözün uzak konaklama düzleminde olmasını sağlıyoruz (bu durumda göz yorulmaz). Normal görüşe sahip bir kişi için B", göz merceğinin odak düzleminde bulunur ve B" sonsuzda elde edilir.

25.3. Mikroskop Büyütme

Mikroskobun temel özelliği açısal olmasıdır. arttırmak. Bu kavram bir büyütecin açısal büyütmesine benzer.

Mikroskop Büyütme- görüş açısı oranıβ", altında nesnenin görüntüsünü görebileceğiniz mercek, görüş açısınaβ, altında nesnenin en iyi görüş mesafesinden “çıplak” gözle görülebildiği (a 0):

25.4. Çözünürlük sınırı. Mikroskop çözünürlüğü

Tüpün optik uzunluğunu artırarak keyfi olarak büyük bir büyütme elde edebileceğiniz ve dolayısıyla bir nesnenin en küçük ayrıntılarını inceleyebileceğiniz izlenimini edinebilirsiniz.

Bununla birlikte, ışığın dalga özellikleri dikkate alındığında, mikroskop kullanılarak fark edilebilen küçük ayrıntıların boyutunun, aşağıdaki özelliklerle ilgili kısıtlamalara tabi olduğu görülmektedir: kırınım mercek açıklığından geçen ışık. Kırınım nedeniyle aydınlatılan bir noktanın görüntüsü bir nokta değil, küçük ışık çemberi. Söz konusu nesnenin parçaları (noktaları) yeterince uzağa yerleştirilmişse mercek, görüntülerini iki ayrı daire şeklinde verecektir ve ayırt edilebilirler (Şekil 25.3, a). Ayırt edilebilir noktalar arasındaki en küçük mesafe, dairelerin "dokunmasına" karşılık gelir (Şekil 25.3, b). Noktalar çok yakınsa, karşılık gelen "daireler" üst üste gelir ve tek bir nesne olarak algılanır (Şekil 25.3, c).

Pirinç. 25.3.Çözünürlük

Mikroskobun bu konudaki yeteneklerini gösteren temel özellik; çözünürlük sınırı.

Çözünürlük sınırı mikroskop (Z) - bir nesnenin iki noktası arasındaki, bunların ayrı nesneler olarak ayırt edilebildiği en küçük mesafe (yani mikroskopta iki nokta olarak algılanır).

Çözünürlük sınırının tersi denir çözünürlük.Çözünürlük sınırı ne kadar düşük olursa çözünürlük o kadar yüksek olur.

Bir mikroskobun teorik çözünürlük sınırı, aydınlatma için kullanılan ışığın dalga boyuna ve açısal açıklık lens.

Açısal açıklık(sen) - bir nesneden objektif merceğe giren bir ışık ışınının aşırı ışınları arasındaki açı.

Mikroskopun havadaki çözünürlük sınırı formülünü türetmeden belirtelim:

Nerede λ - nesneyi aydınlatan ışığın dalga boyu.

Modern mikroskoplar 140°'ye kadar açısal açıklığa sahiptir. Eğer kabul edersek λ = 0,555 µm ise çözünürlük sınırı için Z = 0,3 µm değerini elde ederiz.

25.5. Yararlı mikroskop büyütme

Merceğinin belirli bir çözünürlük sınırı için mikroskobun büyütme oranının ne kadar büyük olması gerektiğini bulalım. Gözün, retinanın yapısına göre belirlenen bir çözünürlük sınırı olduğunu dikkate alalım. Ders 24'te aşağıdaki tahmini elde ettik: göz çözünürlüğü sınırı: ZGL = 145-290 mikron. Gözün mikroskopla ayrılan aynı noktaları ayırt edebilmesi için büyütme gereklidir.

Bu artışa denir faydalı artış.

Formül (25.4)'teki bir nesnenin fotoğrafını çekmek için mikroskop kullanıldığında Z GL yerine film çözünürlük sınırı Z PL'nin kullanılması gerektiğine dikkat edin.

Yararlı mikroskop büyütme- mikroskobun çözünürlük sınırına eşit bir boyuta sahip bir nesnenin, boyutu gözün çözünürlük sınırına eşit bir görüntüye sahip olduğu büyütme.

Mikroskobun Zm ≈0,3 µm) çözünürlük sınırı için yukarıda elde edilen tahmini kullanarak şunu buluruz: G p ~500-1000.

Zaten hiçbir ek ayrıntı görünmeyeceği için mikroskop için daha yüksek bir büyütme değeri elde etmenin bir anlamı yoktur.

Yararlı mikroskop büyütme - hem mikroskobun hem de gözün çözme güçlerinin makul bir birleşimidir.

25.6. Özel Mikroskopi Teknikleri

Mikroskobun çözme gücünü arttırmak (çözünürlük sınırını düşürmek) için özel mikroskopi teknikleri kullanılır.

1. Daldırma. Bazı mikroskoplarda azaltmak için çözünürlük sınırı mercek ile nesne arasındaki boşluk özel bir sıvıyla doldurulur - daldırma. Bu mikroskobun adı daldırma Daldırma etkisi dalga boyunu azaltmaktır: λ = λ 0 /n, nerede λ 0 - ışığın boşluktaki dalga boyu ve n, suya dalmanın kırılma indisidir. Bu durumda mikroskobun çözünürlük limiti aşağıdaki formülle belirlenir (formül (25.3)'ün bir genellemesi):

Daldırma mikroskopları için özel merceklerin oluşturulduğunu unutmayın, çünkü merceğin odak uzaklığı sıvı ortamda değişir.

2. UV mikroskobu. Azaltmak için çözünürlük sınırı Gözle görülemeyen kısa dalga ultraviyole ışınımı kullanırlar. Ultraviyole mikroskoplarda, bir mikro nesne UV ışınlarında incelenir (bu durumda lensler kuvars camdan yapılır ve kayıt fotoğraf filmi veya özel bir floresan ekran üzerinde gerçekleştirilir).

3. Mikroskobik nesnelerin boyutunun ölçülmesi. Bir mikroskop kullanarak gözlemlenen nesnenin boyutunu belirleyebilirsiniz. Bunun için bir göz merceği mikrometresi kullanılır. En basit mercek mikrometresi, üzerine dereceli bir ölçeğin uygulandığı yuvarlak bir cam plakadır. Mikrometre, mercekten elde edilen görüntünün düzlemine yerleştirilir. Mercek üzerinden bakıldığında nesnenin görüntüleri ve ölçek birleşir ve ölçekte hangi mesafenin ölçülen değere karşılık geldiğini hesaplayabilirsiniz. Oküler mikrometrenin bölme fiyatı, önceden bilinen bir nesneye göre belirlenir.

4. Mikroprojeksiyon ve mikrofotografi. Mikroskop kullanarak, bir nesneyi yalnızca mercek aracılığıyla gözlemlemekle kalmaz, aynı zamanda fotoğrafını çekebilir veya bir ekrana yansıtabilirsiniz. Bu durumda, A"B" ara görüntüsünü filme veya ekrana yansıtan özel göz mercekleri kullanılır.

5. Ultramikroskopi. Mikroskop, boyutları çözünürlüğünün ötesinde olan parçacıkları tespit edebilir. Bu yöntem, mikropartiküllerin karanlık bir arka plan üzerinde açık noktalar halinde görülebilmesi nedeniyle eğik aydınlatmayı kullanır, partiküllerin yapısı görülemezken, onların varlığı yalnızca tespit edilebilir.

Teori, mikroskop ne kadar güçlü olursa olsun, 3 mikrondan küçük herhangi bir nesnenin, herhangi bir ayrıntı olmadan, yalnızca bir nokta olarak temsil edileceğini göstermektedir. Ancak bu, bu parçacıkların görülemeyeceği, hareketlerinin izlenebileceği veya sayılamayacağı anlamına gelmez.

Boyutları mikroskobun çözünürlük sınırından daha küçük olan parçacıkları gözlemlemek için, adı verilen bir cihaz ultramikroskop. Ultramikroskopun ana kısmı güçlü bir aydınlatma cihazıdır; Bu şekilde aydınlatılan parçacıklar sıradan bir mikroskopta gözlemlenir. Ultramikroskopi, bir sıvı veya gaz içinde asılı duran küçük parçacıkların güçlü yanal aydınlatma altında görünür hale getirilmesi gerçeğine dayanmaktadır (güneş ışınında görülebilen toz parçacıklarını düşünün).

25.8. Temel kavramlar ve formüller

Tablonun sonu

25.8. Görevler

1. Odak uzaklığı 0,8 cm olan bir mercek, göz merceği odak uzaklığı 2 cm olan mikroskop objektifi olarak kullanılır Tüpün optik uzunluğu 18 cm'dir Mikroskobun büyütülmesi nedir?

2. Açısal açıklığı u = 140 o olan kuru ve daldırma (n = 1,55) lenslerin çözünürlük sınırını belirleyin. Dalga boyunu 0,555 µm olarak alın.

3. Dalga boyunda çözünürlük sınırı nedir? λ = 0,555 µm, eğer sayısal açıklık: A 1 = 0,25, A 2 = 0,65?

4. Turuncu bir filtre (dalga boyu 600 nm) aracılığıyla gözlemlendiğinde 0,25 µm çapındaki bir hücre altı elementi mikroskopta görüntülemek için bir daldırma sıvısı hangi kırılma indeksi kullanılmalıdır? Mikroskopun açıklık açısı 70°'dir.

5. Büyütecin kenarında “x10” yazısı bulunmaktadır.Bu büyütecin odak uzaklığını belirleyiniz.

6. Mikroskop merceği odak uzaklığı f 1 = 0,3 cm, tüp uzunluğu Δ = 15 cm, büyütme Г = 2500. Merceğin odak uzaklığını F 2 bulun. En iyi görüş mesafesi 0 = 25 cm'dir.

Sistem genişletme– gerekli sorunların çözümüne bağlı olarak şu veya bu mikroskobun seçimine dayanan önemli bir faktör. Yarı iletken elemanların 1000x veya daha fazla büyütülmüş bir muayene mikroskobunda incelenmesi gerektiğine hepimiz alışkınız, 50x stereo mikroskopla çalışarak böcekleri inceleyebiliriz ve iyot veya parlakla lekelenmiş soğan pullarını inceledik. Green, okulda monoküler mikroskopta, büyütme kavramının henüz bize aşina olmadığı bir zamanda.

Peki önümüzde dijital veya konfokal bir mikroskop varken ve lenslerin 2000x, 5000x değerleri varken büyütme kavramını nasıl yorumlayacağız? Bu ne anlama geliyor, optik mikroskopta 1000x büyütme, 1000x dijital mikroskoba benzer bir görüntü üretecek mi? Bu makalede bunu öğreneceksiniz.

Optik yakınlaştırma sistemi

Laboratuvar veya stereoskopik mikroskopla çalıştığımızda sistemin mevcut büyütmesini hesaplamak zor değildir. Sistemin tüm optik bileşenlerinin büyütülmesinin çarpılması gerekir. Tipik olarak stereo mikroskop durumunda bu, bir objektif merceği, bir yakınlaştırma merceğini veya büyütücü tamburu ve göz merceklerini içerir.
Geleneksel bir laboratuvar mikroskobu durumunda durum daha da basittir - sistemin toplam büyütülmesi = göz merceklerinin büyütülmesinin çalışma konumunda kurulu merceğin büyütülmesiyle çarpımı. Bazen büyütme veya küçültme faktörüne sahip belirli mikroskop tüpü modelleri bulunduğunu unutmamak önemlidir (özellikle eski Leitz mikroskop modellerinde yaygındır). Ayrıca, stereo mikroskoptaki koaksiyel aydınlatma kaynağı veya tüpün altına yerleştirilmiş bir ara kamera adaptörü gibi ek optik bileşenler ek bir büyütme faktörüne sahip olabilir.

Ek optik bileşenlerin bazen 1'den farklı kendi büyütme faktörleri vardır. Bu durumda, Olympus SZX16 stereomikroskopun koaksiyel aydınlatıcısının (öğe 2) 1,5x ek büyütme faktörü vardır.

Örneğin 10x okülerli bir stereo mikroskop, 2x objektif, 8x zoom lens ve 1,5x faktörlü koaksiyel aydınlatma ünitesinin toplam optik büyütmesi 10x2x8x1,5 = 240x olacaktır.

Işık mikroskobu kullanılarak görüntü almanın şematik diyagramı. Mercek, merceğin oluşturduğu görüntüyü büyütür ve sanal bir görüntü oluşturur.

Bu durumda, optik büyütme (G), optik sistemden görüntü alanına çıkan ışının eğim açısının tanjantının, uzayda kendisine eşlenik olan ışın açısının tanjantına oranı olarak anlaşılmalıdır. nesneler. Veya optik sistem tarafından oluşturulan segmentin optik sistemin eksenine dik olan görüntüsünün uzunluğunun segmentin uzunluğuna oranı

Geometrik sistem büyütme

Sistemin göz mercekleri olmadığı ve büyütülmüş görüntünün, örneğin bir mikroskopta olduğu gibi bir monitör ekranındaki bir kamera tarafından oluşturulduğu durumda, optik sistemin geometrik büyütmesi terimine geçilmelidir.
Mikroskobun geometrik büyütmesi, monitördeki bir nesnenin görüntüsünün doğrusal boyutunun, incelenen nesnenin gerçek boyutuna oranıdır.
Aşağıdaki değerleri çarparak geometrik büyütme değerini elde edebilirsiniz: merceğin optik büyütmesi, kamera adaptörünün optik büyütmesi, monitör köşegeninin kamera matrisinin köşegenine oranı.
Örneğin 50x objektifli bir laboratuvar mikroskobu, 0,5x kamera adaptörü, 1/2,5” kamera ile çalışıp görüntüyü 14” dizüstü bilgisayar monitöründe görüntülerken geometrik sistem büyütmesi = 50x0,5x(14) elde ederiz. /0,4) = 875x.
Ancak 10x göz merceği olması durumunda optik büyütme 500x'e eşit olacaktır.

Monitör ekranında bir nesnenin dijital görüntüsünü oluşturan dijital mikroskoplar, konfokal profilometreler, elektron mikroskopları ve diğer sistemler geometrik büyütme kavramıyla çalışır. Bu kavramın optik zoom ile karıştırılmaması gerekir.

Mikroskop çözünürlüğü

Mikroskobun çözünürlüğü ile büyütmesinin sıkı bir şekilde bağlantılı olduğuna dair yaygın bir yanılgı vardır; büyütme ne kadar yüksek olursa, onun içinden görebileceğimiz nesneler de o kadar küçük olur. Bu doğru değil. En önemli faktör her zaman izin optik sistem. Sonuçta çözülmemiş bir görseli büyütmek bize onun hakkında yeni bilgiler vermeyecektir.

Mikroskobun çözünürlüğü, objektif açıklığının sayısal değerine ve ayrıca aydınlatma kaynağının dalga boyuna bağlıdır. Gördüğünüz gibi bu formülde sistem artış parametresi yok.

burada λ ışık kaynağının ortalama dalga boyudur, NA merceğin sayısal açıklığıdır, R optik sistemin çözünürlüğüdür.

Halojen kaynağı olan (ortalama dalga boyu yaklaşık 500 nm) bir laboratuvar mikroskobu üzerinde NA 0.95 objektif kullanıldığında, yaklaşık 300 nm'lik bir çözünürlük elde ederiz.

Işık mikroskobunun devre şemasından görülebileceği gibi, göz mercekleri bir nesnenin gerçek görüntüsünü büyütür. Örneğin, göz merceklerinin büyütme faktörünü 2 kat artırırsanız (mikroskopa 20x göz merceği yerleştirirseniz), sistemin toplam büyütmesi iki katına çıkar ancak çözünürlük aynı kalır.

Önemli Not

Basit bir laboratuvar mikroskobu oluşturmak için iki seçeneğimiz olduğunu varsayalım. İlkini 40x NA 0.65 objektif ve 10x göz merceği kullanarak yapacağız. İkincisinde 20x NA 0,4 objektif ve 20x göz merceği kullanılacaktır.

Her iki versiyondaki mikroskopların büyütülmesi aynı olacaktır= 400x (objektif ve göz merceği büyütmesinin basit çarpımı). Ve burada ilk versiyondaki çözünürlük daha yüksek olacaktır, 40x merceğin sayısal açıklığı daha büyük olduğundan ikinciye göre daha fazladır. Ayrıca göz merceklerinin görüş alanını da unutmayın, 20x için bu parametre% 20-25 daha düşüktür.

Mikroskoplar mikroorganizmaları tespit etmek ve incelemek için kullanılır. Işık mikroskopları, boyutu en az 0,2 mikron olan mikroorganizmaları (bakteri, protozoa vb.) incelemek için tasarlanmıştır ve elektronik mikroskoplar, daha küçük mikroorganizmaları (virüsler) ve bakterilerin en küçük yapılarını incelemek için tasarlanmıştır.
Modern ışık mikroskopları- bunlar, kullanımı belirli bilgi, beceri ve büyük özen gerektiren karmaşık optik aletlerdir.
Işık mikroskopları tasarım ve optik açısından farklılık gösteren öğrenci, çalışma, laboratuvar ve araştırmaya ayrılmıştır. Yerli mikroskoplar (Biolam, Bimam, Mikmed) hangi gruba ait olduklarını gösteren işaretlere sahiptir (S - öğrenci, R - işçiler, L - laboratuvar, I - araştırma), ekipman bir sayı ile belirtilmiştir.

Mikroskobun mekanik ve optik kısımları vardır.
İLE mekanik parçaşunları içerir: bir tripod (bir taban ve bir tüp tutucudan oluşur) ve üzerine lensleri takmak ve değiştirmek için bir tabanca ile monte edilmiş bir tüp, hazırlık için bir aşama, bir yoğunlaştırıcı ve ışık filtreleri takmak için cihazlar ve ayrıca yerleşik mekanizmalar kaba (makromekanizma, makro vida) ve ince için tripod
(mikromekanizma, mikro vida) nesne tablasını veya tüp tutucuyu hareket ettirir.
Optik parça Mikroskop, objektifler, göz mercekleri ve sahnenin altına yerleştirilmiş bir Abbe yoğunlaştırıcıdan, düz ve içbükey tarafı olan bir aynanın yanı sıra ayrı veya yerleşik bir aydınlatıcıdan oluşan bir aydınlatma sistemi ile temsil edilir. Lensler tabancaya vidalanır ve içinden görüntünün gözlemlendiği karşılık gelen mercek tüpün karşı tarafına takılır. Monoküler (bir göz merceğine sahip) ve binoküler (iki özdeş göz merceğine sahip) tüpler vardır.

Mikroskop ve aydınlatma sisteminin şematik diyagramı

1. Işık kaynağı;
2. Toplayıcı;
3. İris alanı diyaframı;
4. Ayna;
5. İris açıklığı diyaframı;
6. Kondenser;
7. İlaç;
7". Aşağıdakilerden oluşan preparatın büyütülmüş gerçek ara görüntüsü: mercek;
7"". Numunenin mercekten görülen büyütülmüş sanal son görüntüsü;
8. Objektif;
9. Lens çıkışı simgesi;
10. Merceğin alan diyaframı;
11. Mercek;
12. Göz.

Bir görüntü elde etmedeki ana rol şu şekilde oynanır: lens. Bir nesnenin büyütülmüş, gerçek ve ters çevrilmiş bir görüntüsünü oluşturur. Bu görüntü daha sonra normal bir büyütece benzer şekilde büyütülmüş bir sanal görüntü oluşturan bir göz merceğinden bakıldığında daha da büyütülür.
Arttırmak Bir mikroskobun yaklaşık büyütmesi, objektifin büyütülmesi ile göz merceğinin büyütülmesinin çarpılmasıyla belirlenebilir. Ancak büyütme görüntü kalitesini belirlemez. Görüntünün kalitesi, netliği belirlenir mikroskop çözünürlüğü yani birbirine yakın iki noktayı ayrı ayrı ayırt etme yeteneği. Çözünürlük sınırı- bu noktaların ayrı ayrı görülebildiği minimum mesafe, nesnenin aydınlatıldığı ışığın dalga boyuna ve merceğin sayısal açıklığına bağlıdır. Sayısal açıklık ise, objektifin açısal açıklığına ve objektifin ön merceği ile numune arasında bulunan ortamın kırılma indeksine bağlıdır. Açısal açıklık, bir nesnenin içinden geçen ışınların merceğe girebileceği maksimum açıdır. Açıklık ne kadar büyükse ve mercek ile numune arasında bulunan ortamın kırılma indisi camın kırılma indisine ne kadar yakınsa, merceğin çözme gücü de o kadar yüksek olur. Yoğunlaştırıcı açıklığının mercek açıklığına eşit olduğunu varsayarsak çözünürlük formülü aşağıdaki forma sahiptir:

burada R çözünürlük sınırıdır; - dalga boyu; NA - sayısal açıklık.

Ayırt etmek kullanışlı Ve kullanışsız arttırmak. Yararlı büyütme genellikle merceğin 500 ila 1000 katı büyütülmüş sayısal açıklığına eşittir. Daha yüksek göz büyütme yeni ayrıntıları ortaya çıkarmaz ve hiçbir işe yaramaz.
Lens ile numune arasındaki ortama bağlı olarak, küçük ve orta büyütmeli (40 x'e kadar) "kuru" lensler ve maksimum diyafram açıklığı ve büyütmeli (90-100 x) daldırma lensler vardır. “Kuru” mercek, ön mercek ile numune arasında hava bulunan bir mercektir.

Daldırma merceklerin bir özelliği, böyle bir merceğin ön merceği ile preparat arasına, camla aynı (veya ona yakın) kırılma indisine sahip olan, sayısal açıklığın artmasını sağlayan bir daldırma sıvısının yerleştirilmesidir ve Lensin çözünürlüğü. Suya immersiyon lensler için immersiyon sıvısı olarak damıtılmış su kullanılırken, immersiyon lensleri için sedir yağı veya özel sentetik immersiyon yağı kullanılır. Sentetik immersiyon yağının kullanılması tercih edilir çünkü parametreleri daha doğru bir şekilde standartlaştırılmıştır ve sedir yağının aksine merceğin ön merceğinin yüzeyinde kurumaz. Spektrumun ultraviyole bölgesinde çalışan lensler için daldırma sıvısı olarak gliserin kullanılır. Hiçbir durumda immersiyon yağı yerine, özellikle vazelin yağı yerine başka maddeler kullanmamalısınız.
**Lensler kullanılarak elde edilen görüntünün çeşitli dezavantajları vardır: küresel ve renk sapmaları, görüntü alanının eğriliği vb. Birkaç mercekten oluşan merceklerde bu eksiklikler bir dereceye kadar düzeltilir. Bu eksikliklerin düzeltilme derecesine bağlı olarak akromat mercekler daha karmaşık apokromat merceklerden ayrılır. Buna göre görüntü alanındaki eğriliğin düzeltildiği merceklere plankromat ve planapokromat adı verilmektedir. Bu lenslerin kullanılması tüm görüş alanı boyunca keskin bir görüntü oluştururken, geleneksel lenslerle elde edilen görüntü, görüş alanının ortasında ve kenarlarında eşit derecede keskin değildir. Merceğin tüm özellikleri genellikle çerçevesine kazınmıştır: kendi büyütme oranı, diyafram açıklığı, mercek tipi (APO - apokromat, vb.); suya batırılan mercekler VI işaretine ve alt kısımda çerçeve çevresinde beyaz bir halkaya sahiptir; yağlı suya batırılan mercekler MI işaretine ve siyah bir halkaya sahiptir.
Tüm objektifler 0,17 mm kalınlığındaki kapak camıyla çalışacak şekilde tasarlanmıştır.
Lamel kalınlığı özellikle güçlü kuru sistemlerle (40 x) çalışırken görüntü kalitesini etkiler. Daldırma objektifleriyle çalışırken, 0,17 mm'den kalın lamelleri kullanamazsınız çünkü lamelin kalınlığı objektifin çalışma mesafesinden daha büyük olabilir ve bu durumda objektifi numuneye odaklamaya çalışırken, ön kısım objektifin merceği hasar görebilir.
Göz mercekleri iki mercekten oluşur ve ayrıca her biri belirli bir mercek türüyle birlikte kullanılan çeşitli tiplerde gelir; böylece görüntü kusurlarını daha da ortadan kaldırır. Mercek tipi ve büyütme oranı çerçeve üzerinde işaretlenmiştir.
Kondansatör, aydınlatıcıdan gelen ışığı mikroskobun veya aydınlatıcının aynası (tepegöz veya yerleşik aydınlatıcı kullanılması durumunda) tarafından yönlendirilen numune üzerine odaklamak üzere tasarlanmıştır. Kondansatörün parçalarından biri, ilacın uygun şekilde aydınlatılması için önemli olan diyafram diyaframıdır.
Aydınlatıcı, kalın filamanlı düşük voltajlı bir akkor lamba, bir transformatör, bir toplayıcı mercek ve açıklığı preparat üzerindeki aydınlatılan alanın çapını belirleyen bir alan diyaframından oluşur. Ayna, ışığı aydınlatıcıdan yoğunlaştırıcıya yönlendirir. Aydınlatıcıdan yoğunlaştırıcıya gelen ışınların paralelliğini korumak için aynanın sadece düz tarafının kullanılması gerekmektedir.

Aydınlatmayı ayarlama ve mikroskoba odaklanma

Görüntünün kalitesi de büyük ölçüde doğru aydınlatmaya bağlıdır. Bir numuneyi mikroskopi için aydınlatmanın birkaç farklı yolu vardır. En yaygın yol Köhler aydınlatma tesisatları aşağıdaki gibidir:
1) aydınlatıcıyı mikroskop aynasına yerleştirin;
2) aydınlatma lambasını açın ve ışığı mikroskobun düz (!) aynasına yönlendirin;
3) preparatı mikroskop aşamasına yerleştirin;
4) mikroskop aynasını bir parça beyaz kağıtla örtün ve aydınlatıcıdaki lamba soketini hareket ettirerek lamba filamanının görüntüsünü üzerine odaklayın;
5) kağıdı aynadan çıkarın;
6) kondenserin açıklık diyaframını kapatın. Aynayı hareket ettirerek ve lamba yuvasını hafifçe hareket ettirerek filamanın görüntüsü açıklık diyaframına odaklanır. Aydınlatıcının mikroskoptan uzaklığı, lamba filamanının görüntüsü yoğunlaştırıcının açıklık diyaframının çapına eşit olacak şekilde olmalıdır (açıklık diyaframı, tabanın sağ tarafına yerleştirilen düz bir ayna kullanılarak gözlemlenebilir). mikroskop).
7) kondansatörün açıklık diyaframını açın, aydınlatıcının alan diyaframının açıklığını azaltın ve lamba yoğunluğunu önemli ölçüde azaltın;
8) düşük büyütmede (10x), göz merceğinden bakıldığında preparatın keskin bir görüntüsü elde edilir;
9) Aynayı hafifçe çevirerek parlak bir noktaya benzeyen alan diyaframının görüntüsü görüş alanının merkezine aktarılır. Kondansatörün indirilmesi ve yükseltilmesiyle, hazırlık düzlemindeki alan diyaframının kenarlarının keskin bir görüntüsü elde edilir (etraflarında renkli bir kenar görülebilir);
10) aydınlatıcının alan diyaframını görüş alanının kenarlarına kadar açın, lambanın filaman yoğunluğunu artırın ve yoğunlaştırıcı açıklık diyaframının açıklığını hafifçe (1/3 oranında) azaltın;
11) Lens değiştirirken ışık ayarlarını kontrol etmeniz gerekmektedir.
Köhler ışık ayarını tamamladıktan sonra kondenserin konumunu ve alan ve diyafram diyaframının açıklığını değiştiremezsiniz. İlacın aydınlatması yalnızca nötr filtrelerle veya bir reostat kullanılarak lambanın yoğunluğu değiştirilerek ayarlanabilir. Kondenser açıklık diyaframının aşırı açılması görüntü kontrastında önemli bir azalmaya yol açabilir ve yetersiz açılma, görüntü kalitesinde önemli bir bozulmaya (kırınım halkalarının görünümü) yol açabilir. Açıklık diyaframının doğru açıklığını kontrol etmek için, göz merceğini çıkarmak ve tüpün içine bakarak ışık alanını üçte bir oranında kaplayacak şekilde açmak gerekir. Düşük büyütmeli merceklerle (10x'e kadar) çalışırken numuneyi uygun şekilde aydınlatmak için üst yoğunlaştırıcı merceğin vidasını söküp çıkarmak gerekir.
Dikkat! Yüksek büyütme sağlayan lenslerle çalışırken - güçlü kuru (40x) ve daldırma (90x) sistemlerle, ön merceğe zarar vermemek için odaklanırken aşağıdaki tekniği kullanın: yandan bakın, merceği makro ile indirin neredeyse numuneyle temas edene kadar vidalayın, ardından göz merceğine bakarak, bir makro vida kullanarak, bir görüntü görünene kadar merceği çok yavaş kaldırın ve bir mikro vida kullanarak mikroskobun son odaklaması gerçekleştirilir.

Mikroskop Bakımı

Mikroskopla çalışırken çok fazla güç kullanmayın. Merceklerin, aynaların ve filtrelerin yüzeylerine parmaklarınızla dokunmayın.
Merceklerin iç yüzeylerini ve tüpün prizmalarını tozdan korumak için göz merceğini her zaman tüpün içinde bırakmalısınız. Lenslerin dış yüzeylerini temizlerken eterle yıkanmış yumuşak bir fırça ile üzerlerindeki tozu almanız gerekir. Gerekirse mercek yüzeylerini iyi yıkanmış, sabun içermeyen keten veya kambrik bir bezle, saf benzin, eter veya optikleri temizlemek için özel bir karışımla hafifçe nemlendirilmiş bir bezle dikkatlice silin. Lens optiklerinin ksilen ile silinmesi önerilmez çünkü bu onların parçalanmasına neden olabilir.
Dışı gümüş kaplamalı aynalardaki tozu ancak lastik bir ampulle üfleyerek temizleyebilirsiniz. Silinemezler. Ayrıca lensleri kendiniz sökemez veya sökemezsiniz - bu onların zarar görmesine yol açacaktır. Mikroskop üzerindeki çalışmanın tamamlanmasının ardından, kalan immersiyon yağının yukarıda belirtilen yöntemi kullanarak ön objektif merceğinden dikkatlice çıkarılması gerekir. Daha sonra tablayı (veya sabit tablalı mikroskoplarda yoğunlaştırıcıyı) indirin ve mikroskobu bir kapakla kapatın.
Mikroskopun görünümünü korumak için, asitsiz vazelinle hafifçe ıslatılmış yumuşak bir bezle ve ardından kuru, yumuşak, temiz bir bezle periyodik olarak silmek gerekir.

Geleneksel ışık mikroskobuna ek olarak, boyanmamış mikroorganizmaların incelenmesine olanak tanıyan mikroskopi yöntemleri de vardır: faz kontrastı , karanlık alan Ve ışıldayan mikroskopi. Boyutu ışık mikroskobunun çözünürlüğünden daha küçük olan mikroorganizmaları ve yapılarını incelemek için kullanın.

Görüntü kalitesi azimli mikroskop çözünürlüğü yani mikroskop optiklerinin birbirine yakın iki noktayı ayrı ayrı ayırt edebildiği minimum mesafe. çözünürlük objektifin sayısal açıklığına, yoğunlaştırıcıya ve numunenin aydınlatıldığı ışığın dalga boyuna bağlıdır. Sayısal açıklık (açıklık), objektifin ön merceği ile yoğunlaştırıcı ve numune arasında bulunan ortamın açısal açıklığına ve kırılma indeksine bağlıdır.

Lens Açısal Açıklığı- bu, preparattan geçen ışınların merceğe girebileceği maksimum açıdır (AOB). Lens Sayısal Açıklığı açısal açıklığın yarısının sinüsü ile cam slayt ile objektif merceğin ön merceği arasında bulunan ortamın kırılma indisinin çarpımına eşittir. N.A. = n sinα burada, N.A. - sayısal açıklık; n, numune ile mercek arasındaki ortamın kırılma indisidir; sinα, diyagramdaki AOB açısının yarısına eşit olan α açısının sinüsüdür.

Bu nedenle, kuru sistemlerin açıklığı (ön objektif merceği ile hava hazırlığı arasında) 1'den fazla olamaz (genellikle 0,95'ten fazla değildir). Numune ile objektif arasına yerleştirilen ortama daldırma sıvısı veya daldırma adı verilir ve daldırma sıvısıyla çalışmak üzere tasarlanmış objektife daldırma denir. Havadan daha yüksek kırılma indeksine sahip daldırma sayesinde merceğin sayısal açıklığını ve dolayısıyla çözünürlüğünü artırmak mümkündür.

Lenslerin sayısal açıklığı her zaman çerçevelerinin üzerine kazınmıştır.
Mikroskobun çözünürlüğü aynı zamanda yoğunlaştırıcının açıklığına da bağlıdır. Yoğunlaştırıcı açıklığının mercek açıklığına eşit olduğunu düşünürsek, çözünürlük formülü R=λ/2NA biçiminde olur; burada R, çözünürlük sınırıdır; λ - dalga boyu; N.A - sayısal açıklık. Bu formülden, görünür ışıkta (spektrumun yeşil kısmı - λ = 550 nm) gözlemlendiğinde çözünürlüğün (çözünürlük sınırı) > 0,2 µm olamayacağı açıktır.

Mikroskop objektifinin sayısal açıklığının görüntü kalitesi üzerindeki etkisi

Optik çözünürlüğü artırmanın yolları

Hem mercek tarafından hem de ışık kaynağı tarafından geniş bir ışık konisi açısının seçilmesi. Bu sayede mercekteki çok ince yapılardan kırılan ışık ışınlarının daha fazla toplanması mümkün olur. Bu nedenle çözünürlüğü artırmanın ilk yolu, sayısal açıklığı hedefin sayısal açıklığıyla eşleşen bir yoğunlaştırıcı kullanmaktır.

İkinci yöntem ise ön objektif merceği ile kapak camı arasına daldırma sıvısı kullanmaktır. İlk formülde açıklanan n ortamının kırılma indisini bu şekilde etkileriz. Daldırma sıvıları için önerilen optimum değeri 1,51'dir.

Daldırma sıvıları

Daldırma sıvıları Sayısal açıklığın arttırılması ve buna bağlı olarak, bu sıvılarla çalışmak üzere özel olarak tasarlanmış ve buna göre işaretlenmiş daldırma hedeflerinin çözünürlüğünün arttırılması gerekmektedir. Objektif ile numune arasına yerleştirilen daldırma sıvılarının kırılma indisi havadan daha yüksektir. Bu nedenle, nesnenin en küçük detayları tarafından saptırılan ışık ışınları, preparattan çıkıp merceğe girerken dağılmaz ve bu da çözünürlüğün artmasına neden olur.

Suya batırma lensler (beyaz halkayla işaretlenmiştir), yağa batırma lensler (siyah halka), gliserine batırma lensler (sarı halka) ve monobromonaftalen daldırma lensler (kırmızı halka) vardır. Biyolojik preparatların ışık mikroskobunda suya ve yağa daldırma objektifleri kullanılır. Özel kuvars gliserol daldırma hedefleri, kısa dalga ultraviyole radyasyonu iletir ve ultraviyole (floresan ile karıştırılmamalıdır) mikroskopisi (yani, ultraviyole ışınlarını seçici olarak emen biyolojik nesneleri incelemek için) için tasarlanmıştır. Monobromlu naftalin daldırma hedefleri biyolojik nesnelerin mikroskopisinde kullanılmaz.

Suya daldırmalı lensler için daldırma sıvısı olarak damıtılmış su kullanılır ve yağa daldırmalı lensler için daldırma sıvısı olarak belirli bir kırılma indeksine sahip doğal (sedir) veya sentetik yağ kullanılır.

Diğer daldırma sıvılarından farklı olarak Yağa daldırma Homojendir çünkü camın kırılma indisine eşit veya çok yakın bir kırılma indisine sahiptir. Tipik olarak bu kırılma indisi (n), belirli bir spektral çizgi ve belirli bir sıcaklık için hesaplanır ve yağ şişesi üzerinde gösterilir. Örneğin, = 20°C sıcaklıkta sodyum spektrumunda spektral çizgi D için bir kapak camıyla çalışmak için daldırma yağının kırılma indisi, bir kapak camı olmadan çalışmak için 1,515'tir (nD 20 = 1,515) (nD 20 = 1,520) ).

Apokromatik merceklerle çalışmak için dağılım da normalleştirilir, yani spektrumun farklı çizgileri için kırılma indislerindeki fark.

Sentetik immersiyon yağının kullanılması tercih edilir çünkü parametreleri daha doğru bir şekilde standartlaştırılmıştır ve sedir yağının aksine merceğin ön merceğinin yüzeyinde kurumaz.

Yukarıdakileri göz önünde bulundurarak, hiçbir durumda immersiyon yağı ve özellikle vazelin yağı için taşıyıcı maddeler kullanmamalısınız. Bazı mikroskopi yöntemlerinde, yoğunlaştırıcının açıklığını arttırmak için yoğunlaştırıcı ile numune arasına bir daldırma sıvısı (genellikle damıtılmış su) yerleştirilir.