Формула за разделителна способност на микроскоп. Увеличение на микроскопа. Разделителна способност на микроскопа

Микроскопът е предназначен да наблюдава малки обекти с по-голямо увеличение и по-голяма разделителна способност, отколкото осигурява лупата. Оптичната система на микроскопа се състои от две части: леща и окуляр. Микроскопската леща формира истинско увеличено обратно изображение на обекта в предната фокална равнина на окуляра. Окулярът действа като лупа и формира виртуално изображение на най-доброто разстояние за гледане. По отношение на целия микроскоп, въпросният обект се намира в предната фокална равнина.

Увеличение на микроскопа

Действието на микролещата се характеризира с нейното линейно увеличение: V ob = -Δ/F\" ob * F\" ob - фокусно разстояние на микролещата * Δ - разстоянието между задния фокус на лещата и предния фокус на окуляр, наречен оптичен интервал или оптична дължина на тръбата.

Изображението, създадено от обектива на микроскопа в предната фокална равнина на окуляра, се гледа през окуляра, който действа като лупа с видимо увеличение:

G добре =¼ F добре

Общото увеличение на микроскопа се определя като произведение от увеличението на обектива и увеличението на окуляра: G=V около *G приблизително

Ако е известно фокусното разстояние на целия микроскоп, тогава неговото видимо увеличение може да се определи по същия начин, както за лупа:

По правило увеличението на съвременните микроскопски лещи е стандартизирано и възлиза на поредица от числа: 10, 20, 40, 60, 90, 100 пъти. Увеличенията на окуляра също имат много специфични стойности, например 10, 20, 30 пъти. Всички съвременни микроскопи имат набор от обективи и окуляри, които са специално проектирани и произведени, за да пасват заедно, така че да могат да се комбинират за постигане на различни увеличения.

Зрително поле на микроскопа

Зрителното поле на микроскопа зависи от ъгловото поле на окуляра ω , в рамките на който се получава изображение с доста добро качество: 2y=500*tg(ω)/G * G - увеличение на микроскопа

За дадено ъглово поле на окуляра линейното поле на микроскопа в пространството на обекта е толкова по-малко, колкото по-голямо е видимото му увеличение.

Диаметър на изходната зеница на микроскопа

Диаметърът на изходната зеница на микроскоп се изчислява, както следва:
където А е предната бленда на микроскопа.

Диаметърът на изходната зеница на микроскопа обикновено е малко по-малък от диаметъра на зеницата на окото (0,5 - 1 mm).

Когато наблюдавате през микроскоп, зеницата на окото трябва да бъде подравнена с изходната зеница на микроскопа.

Разделителна способност на микроскопа

Една от най-важните характеристики на микроскопа е неговата разделителна способност. Според теорията на дифракцията на Abbe, границата на линейната разделителна способност на микроскопа, тоест минималното разстояние между точките на обект, които се изобразяват като отделни, зависи от дължината на вълната и числовата апертура на микроскопа:
Максималната постижима разделителна способност на оптичен микроскоп може да се изчисли въз основа на израза за апертурата на микроскопа. Ако вземем предвид, че максималната възможна стойност на синуса на ъгъла е единица, тогава за средната дължина на вълната можем да изчислим разделителната способност на микроскопа:

Има два начина за увеличаване на разделителната способност на микроскоп: * Чрез увеличаване на апертурата на обектива, * Чрез намаляване на дължината на вълната на светлината.

Потапяне

За да се увеличи апертурата на лещата, пространството между съответния обект и лещата се запълва с така наречената имерсионна течност - прозрачно вещество с коефициент на пречупване по-голям от единица. Като такава течност се използват вода, кедрово масло, разтвор на глицерин и други вещества. Апертурите на имерсионните обективи с голямо увеличение достигат стойността , тогава максималната постижима разделителна способност на имерсионния оптичен микроскоп ще бъде.

Приложение на ултравиолетовите лъчи

За да се увеличи разделителната способност на микроскопа, вторият метод използва ултравиолетови лъчи, чиято дължина на вълната е по-къса от тази на видимите лъчи. В този случай трябва да се използва специална оптика, която е прозрачна за ултравиолетова светлина. Тъй като човешкото око не възприема ултравиолетовото лъчение, е необходимо или да се прибегне до средства, които превръщат невидимото ултравиолетово изображение във видимо, или да се снима изображението в ултравиолетови лъчи. При дължината на вълната разделителната способност на микроскопа ще бъде.

В допълнение към повишената разделителна способност, методът за наблюдение на ултравиолетовата светлина има и други предимства. Обикновено живите обекти са прозрачни във видимата област на спектъра и следователно са предварително оцветени преди наблюдение. Но някои обекти (нуклеинови киселини, протеини) имат селективна абсорбция в ултравиолетовата област на спектъра, поради което могат да бъдат „видими“ в ултравиолетова светлина без оцветяване.

2. Оптична система на микроскопа.

3. Увеличение на микроскопа.

4. Ограничение на разделителната способност. Разделителна способност на микроскопа.

5. Полезно увеличение на микроскопа.

6. Специални техники на микроскопия.

7. Основни понятия и формули.

8. Задачи.

Способността на окото да разграничава малки детайли на даден обект зависи от размера на изображението върху ретината или от зрителния ъгъл. За увеличаване на зрителния ъгъл се използват специални оптични устройства.

25.1. Лупа

Най-простото оптично устройство за увеличаване на зрителния ъгъл е лупа, която е късофокусна събирателна леща (f = 1-10 cm).

Въпросният предмет се поставя между лупата и предната й част фокуспо такъв начин, че виртуалният му образ да е в границите на акомодация за дадено око. Обикновено се използват равнините на далечно или близко настаняване. Последният случай е за предпочитане, тъй като окото не се уморява (пръстеновидният мускул не е напрегнат).

Нека сравним ъглите на видимост, при които даден обект се вижда, когато се гледа „гол“ нормалнос око и с лупа. Ще извършим изчисленията за случая, когато се получава виртуално изображение на обект в безкрайност (далечната граница на акомодация).

Когато гледате обект с невъоръжено око (фиг. 25.1, а), за да получите максимален зрителен ъгъл, обектът трябва да бъде поставен на разстоянието за най-добро виждане a 0. Зрителният ъгъл, от който се вижда обектът, е равен на β = B/a 0 (B е размерът на обекта).

Когато гледате обект с лупа (фиг. 25.1, b), той се поставя в предната фокална равнина на лупата. В този случай окото вижда въображаем образ на обект B", разположен в безкрайно отдалечена равнина. Ъгълът на видимост, под който се вижда изображението, е равен на β" ≈ B/f.

Ориз. 25.1.Ъгли на видимост: А- с просто око; b- използване на лупа: f - фокусно разстояние на лупата; N - възлова точка на окото

Лупа- съотношение на зрителния ъгълβ", под който можете да видите изображението на обект в лупа, до зрителния ъгълβ, при което даден обект се вижда с "невъоръжено" нормално око от най-доброто разстояние за зрение:

Увеличенията на увеличението са различни за късогледите и далекогледите очи, тъй като те имат различни разстояния за най-добро виждане.

Нека представим без извод формулата за увеличението, дадено от лупа, използвана от късогледо или далекогледо око при формиране на изображение в равнината на далечна акомодация:

където разстоянието е далечната граница на акомодацията.

Формула (25.1) предполага, че чрез намаляване на фокусното разстояние на лупата можете да постигнете произволно голямо увеличение. По принцип това е вярно. Въпреки това, когато фокусното разстояние на лупата се намали и размерът му остане същият, възникват аберации, които отричат ​​целия ефект от увеличението. Следователно лупите с една леща обикновено имат 5-7x увеличение.

За намаляване на аберациите се правят сложни лупи, състоящи се от две или три лещи. В този случай е възможно да се постигне 50-кратно увеличение.

25.2. Оптична система на микроскоп

По-голямо увеличение може да се постигне чрез гледане с лупа на действителното изображение на обект, създадено от друга леща или система от лещи. Такова оптично устройство се изпълнява в микроскоп. В този случай се нарича лупата окуляр,а другата леща - лещи.Пътят на лъчите в микроскоп е показан на фиг. 25.2.

Обект B се поставя близо до предния фокус на обектива (F около) по такъв начин, че неговото действително, увеличено изображение B" е разположено между окуляра и неговия преден фокус. Когато

Ориз. 25.2.Пътят на лъчите в микроскоп.

В този случай окулярът дава въображаемо увеличено изображение B", което се вижда от окото.

Променяйки разстоянието между обекта и лещата, ние гарантираме, че изображението B" е в равнината на далечната акомодация на окото (в този случай окото не се уморява). За човек с нормално зрение B" е разположен във фокалната равнина на окуляра, а B" се получава в безкрайност.

25.3. Увеличение на микроскопа

Основната характеристика на микроскопа е неговият ъгъл нараства.Тази концепция е подобна на ъгловото увеличение на лупа.

Увеличение на микроскопа- съотношение на зрителния ъгълβ", под който можете да видите изображението на обекта в окуляр,към зрителния ъгълβ, при което обектът се вижда с „невъоръжено“ око от разстоянието за най-добро виждане (a 0):

25.4. Ограничение на разделителната способност. Разделителна способност на микроскопа

Може да останете с впечатлението, че чрез увеличаване на оптичната дължина на тръбата можете да постигнете произволно голямо увеличение и следователно да изследвате най-малките детайли на даден обект.

Въпреки това, вземането под внимание на вълновите свойства на светлината показва, че размерът на малките детайли, различими с помощта на микроскоп, е предмет на ограничения, свързани с дифракциясветлина, преминаваща през отвора на лещата. Поради дифракцията изображението на осветена точка не е точка, а малък светъл кръг.Ако частите (точките) на разглеждания обект са разположени достатъчно далеч, тогава лещата ще даде техните изображения под формата на два отделни кръга и те могат да бъдат разграничени (фиг. 25.3, а). Най-малкото разстояние между различимите точки съответства на „докосването“ на кръговете (фиг. 25.3, b). Ако точките са разположени много близо, тогава съответните „кръгове“ се припокриват и се възприемат като един обект (фиг. 25.3, c).

Ориз. 25.3.Резолюция

Основната характеристика, показваща възможностите на микроскопа в това отношение е ограничение на резолюцията.

Ограничение на разделителната способностмикроскоп (Z) - най-малкото разстояние между две точки на обект, при което те се различават като отделни обекти (т.е. възприемат се в микроскоп като две точки).

Извиква се реципрочната стойност на разделителната граница резолюция.Колкото по-ниска е границата на разделителната способност, толкова по-голяма е разделителната способност.

Теоретичната граница на разделителна способност на микроскоп зависи от дължината на вълната на светлината, използвана за осветяване и ъглова блендалещи.

Ъглова бленда(ф) - ъгълът между крайните лъчи на светлинен лъч, влизащ в лещата на обектива от обект.

Нека посочим без извод формулата за границата на разделителна способност на микроскоп във въздуха:

Където λ - дължината на вълната на светлината, която осветява обекта.

Съвременните микроскопи имат ъглова бленда до 140°. Ако приемем λ = 0,555 µm, тогава получаваме за границата на разделителната способност стойността Z = 0,3 µm.

25.5. Полезно увеличение на микроскопа

Нека разберем колко голямо трябва да бъде увеличението на микроскопа за дадена граница на разделителната способност на неговия обектив. Нека вземем предвид, че окото има своя граница на разделителна способност, която се определя от структурата на ретината. В лекция 24 получихме следната оценка за ограничение на разделителната способност на очите: ZGL = 145-290 µm. За да може окото да различи същите точки, които са разделени от микроскоп, е необходимо увеличение.

Това увеличение се нарича полезно увеличение.

Обърнете внимание, че когато използвате микроскоп за фотографиране на обект във формула (25.4), вместо Z GL трябва да се използва границата на разделителната способност на филма Z PL.

Полезно увеличение на микроскопа- увеличение, при което обект с размер, равен на разделителната способност на микроскопа, има изображение, чийто размер е равен на разделителната способност на окото.

Използвайки получената по-горе оценка за границата на разделителната способност на микроскопа Z m ≈0,3 µm), намираме: G p ~500-1000.

Няма смисъл да се постига по-висока стойност на увеличение за микроскопа, тъй като така или иначе няма да се виждат допълнителни детайли.

Полезно увеличение на микроскопа - това е разумна комбинация от разделителната способност както на микроскопа, така и на окото.

25.6. Специални техники за микроскопия

Специални микроскопски техники се използват за увеличаване на разделителната способност (намаляване на границата на разделителната способност) на микроскопа.

1. Потапяне.В някои микроскопи за намаляване ограничение на резолюциятапространството между лещата и обекта се запълва със специална течност - потапяне.Този микроскоп се нарича потапянеЕфектът от потапянето е намаляване на дължината на вълната: λ = λ 0 /n, където λ 0 - дължината на вълната на светлината във вакуум, а n е индексът на пречупване на потапяне. В този случай границата на разделителна способност на микроскопа се определя от следната формула (обобщение на формула (25.3)):

Имайте предвид, че за потапящи микроскопи са създадени специални лещи, тъй като фокусното разстояние на лещата се променя в течна среда.

2. UV микроскопия.За намаляване ограничение на резолюциятаТе използват късовълнова ултравиолетова радиация, невидима за окото. В ултравиолетовите микроскопи микрообектът се изследва в ултравиолетови лъчи (в този случай лещите са направени от кварцово стъкло и регистрацията се извършва върху фотолента или върху специален флуоресцентен екран).

3. Измерване на размера на микроскопични обекти.С помощта на микроскоп можете да определите размера на наблюдавания обект. За това се използва окулярен микрометър. Най-простият окулярен микрометър е кръгла стъклена пластина, върху която е нанесена градуирана скала. Микрометърът е инсталиран в равнината на изображението, получено от лещата. При гледане през окуляра изображенията на обекта и скалата се сливат и можете да изчислите кое разстояние по скалата отговаря на измерената стойност. Цената на разделението на очния микрометър се определя предварително от известен обект.

4. Микропроекция и микрофотография.С помощта на микроскоп можете не само да наблюдавате обект през окуляр, но и да го снимате или проектирате на екран. В този случай се използват специални окуляри, които проектират междинното изображение A"B" върху филма или екрана.

5. Ултрамикроскопия.Микроскопът може да открие частици, чиито размери са извън неговата разделителна способност. Този метод използва наклонено осветление, поради което микрочастиците се виждат като светли точки на тъмен фон, докато структурата на частиците не може да се види, фактът на тяхното присъствие може само да се установи.

Теорията показва, че независимо колко мощен е микроскопът, всеки обект, по-малък от 3 микрона, ще бъде представен в него просто като една точка, без никакви подробности. Но това не означава, че такива частици не могат да се видят, техните движения могат да бъдат наблюдавани или не могат да бъдат преброени.

За да наблюдавате частици, чиито размери са по-малки от границата на разделителна способност на микроскопа, устройство, наречено ултрамикроскоп.Основната част на ултрамикроскопа е силно осветително устройство; Осветените по този начин частици се наблюдават в обикновен микроскоп. Ултрамикроскопията се основава на факта, че малките частици, суспендирани в течност или газ, стават видими при силно странично осветление (помислете за прахови частици, видими на слънчев лъч).

25.8. Основни понятия и формули

Край на масата

25.8. Задачи

1. Като обектив на микроскоп се използва леща с фокусно разстояние 0,8 см с фокусно разстояние на окуляра 2 см. Оптичната дължина на тубуса е 18 см. Какво е увеличението на микроскопа?

2. Определете границата на разделителна способност на сухи и потапящи (n = 1,55) лещи с ъглова бленда u = 140 o. Приемете дължината на вълната за 0,555 µm.

3. Каква е границата на разделителната способност при дължина на вълната? λ = 0,555 µm, ако числовата апертура е: A 1 = 0,25, A 2 = 0,65?

4. Какъв индекс на пречупване трябва да се използва с течност за потапяне, за да се види субклетъчен елемент с диаметър 0,25 μm в микроскоп, когато се наблюдава през оранжев филтър (дължина на вълната 600 nm)? Ъгълът на отвора на микроскопа е 70°.

5. Върху ръба на лупата има надпис “x10”.Определете фокусното разстояние на тази лупа.

6. Фокусно разстояние на лещата на микроскопа f 1 = 0,3 cm, дължина на тръбата Δ = 15 cm, увеличение Г = 2500. Намерете фокусното разстояние F 2 на окуляра. Най-доброто разстояние за виждане е 0 = 25 cm.

Разширяване на системата– важен фактор, на който се основава изборът на един или друг микроскоп в зависимост от решаването на необходимите проблеми. Всички сме свикнали с факта, че е необходимо да се проверяват полупроводникови елементи на инспекционен микроскоп с увеличение от 1000 пъти или повече, можем да изучаваме насекоми, като работим с 50-кратен стереомикроскоп, и изучавахме люспи от лук, оцветени с йод или брилянт зелено, в училище на монокулярен микроскоп, когато концепцията за увеличение все още не ни беше позната.

Но как да тълкуваме понятието увеличение, когато имаме цифров или конфокален микроскоп пред нас и лещите имат стойности от 2000x, 5000x? Какво означава това, ще създаде ли 1000x увеличение на оптичен микроскоп изображение, подобно на 1000x цифров микроскоп? Ще научите за това в тази статия.

Система за оптично увеличение

Когато работим с лабораторен или стереоскопичен микроскоп, изчисляването на текущото увеличение на системата не е трудно. Необходимо е да се увеличи многократно увеличението на всички оптични компоненти на системата. Обикновено, в случай на стереомикроскоп, това включва обектив, вариообектив или увеличителен барабан и окуляри.
В случай на конвенционален лабораторен микроскоп ситуацията е още по-проста - общото увеличение на системата = увеличението на окулярите, умножено по увеличението на лещата, инсталирана в работно положение. Важно е да запомните, че понякога има специфични модели тръби на микроскопи, които имат коефициент на увеличение или намаляване (особено често срещано при по-старите модели микроскопи Leitz). Освен това допълнителните оптични компоненти, било то източник на коаксиално осветление в стереомикроскоп или адаптер за междинна камера, разположен под тръбата, може да имат допълнителен коефициент на увеличение.

Допълнителните оптични компоненти понякога имат свой собствен коефициент на увеличение, различен от 1. В този случай коаксиалният осветител (елемент 2) на стереомикроскопа Olympus SZX16 има допълнителен коефициент на увеличение от 1,5x.

Например стереомикроскоп с окуляри 10x, обектив 2x, обектив с увеличение 8x и коаксиален осветителен модул с коефициент 1,5x ще има общо оптично увеличение 10x2x8x1,5 = 240x.

Схематична диаграма за получаване на изображение с помощта на светлинен микроскоп. Окулярът увеличава изображението, създадено от обектива, и формира виртуално изображение.

В този случай оптичното увеличение (G) трябва да се разбира като съотношението на тангенса на ъгъла на наклона на лъча, излизащ от оптичната система в пространството на изображението, към тангенса на ъгъла на лъча, свързан към него в пространството на обекти. Или съотношението на дължината на изображението на сегмента, образуван от оптичната система, перпендикулярен на оста на оптичната система, към дължината на самия сегмент

Увеличение на геометрична система

В случай, че системата няма окуляри, а увеличеното изображение се формира от камера на екрана на монитора, например, като на микроскоп, трябва да се премине към термина геометрично увеличение на оптичната система.
Геометричното увеличение на микроскопа е съотношението на линейния размер на изображението на обект на монитора към реалния размер на обекта, който се изследва.
Можете да получите стойността на геометричното увеличение, като умножите следните стойности: оптично увеличение на обектива, оптично увеличение на адаптера на камерата, съотношение на диагонала на монитора към диагонала на матрицата на камерата.
Например, когато работим върху лабораторен микроскоп с обектив 50x, адаптер за камера 0,5x, камера 1/2,5" и показване на изображението на 14" монитор на лаптоп, ще получим геометрично системно увеличение = 50x0,5x(14 /0,4) = 875x.
Въпреки че оптичното увеличение ще бъде равно на 500x в случай на 10x окуляри.

Цифрови микроскопи, конфокални профилометри, електронни микроскопи и други системи, които формират цифрово изображение на обект на екрана на монитора, работят с концепцията за геометрично увеличение. Тази концепция не трябва да се бърка с оптичното увеличение.

Разделителна способност на микроскопа

Има широко разпространено погрешно схващане, че разделителната способност на микроскопа и неговото увеличение са тясно свързани - колкото по-голямо е увеличението, толкова по-малки обекти можем да видим през него. Това не е вярно. Най-важният фактор е винаги разрешениеоптична система. В крайна сметка уголемяването на неразрешено изображение няма да ни даде нова информация за него.

Разделителната способност на микроскопа зависи от числената стойност на апертурата на обектива, както и от дължината на вълната на източника на светлина. Както можете да видите, в тази формула няма параметър за увеличение на системата.

където λ е средната дължина на вълната на светлинния източник, NA е числената апертура на лещата, R е разделителната способност на оптичната система.

Когато използваме обектив NA 0,95 на лабораторен микроскоп с източник на халоген (средна дължина на вълната около 500 nm), получаваме разделителна способност от около 300 nm.

Както може да се види от електрическата схема на светлинния микроскоп, окулярите увеличават действителното изображение на обект. Ако например увеличите коефициента на увеличение на окулярите 2 пъти (поставете 20x окуляри в микроскопа), тогава общото увеличение на системата ще се удвои, но разделителната способност ще остане същата.

Важна забележка

Да приемем, че имаме две възможности за изграждане на прост лабораторен микроскоп. Ще изградим първия с помощта на обектив 40x NA 0,65 и окуляри 10x. Вторият ще използва 20x NA 0.4 обектив и 20x окуляри.

Увеличението на микроскопите и в двете версии ще бъде еднакво= 400x (просто умножение на увеличението на обектива и окуляра). И тук резолюцията в първата версия ще бъде по-висока,отколкото във втория, тъй като числовата апертура на 40x обектива е по-голяма. Освен това не забравяйте за зрителното поле на окулярите, за 20x този параметър е с 20-25% по-нисък.

Микроскопите се използват за откриване и изследване на микроорганизми. Светлинните микроскопи са предназначени за изследване на микроорганизми с размер най-малко 0,2 микрона (бактерии, протозои и др.), а електронните микроскопи са предназначени за изследване на по-малки микроорганизми (вируси) и най-малките структури от бактерии.
Модерен светлинни микроскопи- това са сложни оптични инструменти, боравенето с които изисква определени знания, умения и голямо внимание.
Светлинните микроскопи са разделени на студентски, работни, лабораторни и изследователски, различаващи се по дизайн и оптика. Домашните микроскопи (Biolam, Bimam, Mikmed) имат обозначения, показващи към коя група принадлежат (S - студент, R - работници, L - лаборатория, I - изследване), оборудването е обозначено с номер.

Микроскопът има механични и оптични части.
ДА СЕ механична частвключва: статив (състоящ се от основа и тубусен държач) и монтирана върху него туба с револвер за закрепване и смяна на обективи, етап за подготовка, устройства за закрепване на кондензатор и светлинни филтри, както и механизми, вградени в статива за грубо (макромеханизъм, макровинт) и фино
(микромеханизъм, микровинт) преместване на предметната сцена или държача на тръбата.
Оптична частМикроскопът е представен от обективи, окуляри и осветителна система, която от своя страна се състои от кондензатор на Abbe, разположен под предметния стол, огледало с плоска и вдлъбната страна, както и отделен или вграден осветител. Лещите се завинтват в револвера, а от противоположната страна на тръбата се монтира съответният окуляр, през който се наблюдава изображението. Има монокулярни (с един окуляр) и бинокулярни (с два еднакви окуляра) тръби.

Принципна схема на микроскоп и осветителна система

1. Източник на светлина;
2. Колектор;
3. Диафрагма на полето на ириса;
4. Огледало;
5. Ирисова апертурна диафрагма;
6. Кондензатор;
7. Лекарство;
7". Увеличен реален междинен образ на препарата, образуван от: леща;
7"". Увеличено виртуално крайно изображение на образеца, гледано през окуляра;
8. Обектив;
9. Икона за изход на обектива;
10. Полева диафрагма на окуляра;
11. Окуляр;
12. Око.

Основната роля в получаването на изображение играе лещи. Изгражда уголемен, реален и обърнат образ на обект. След това това изображение се увеличава допълнително, когато се гледа през окуляр, който, подобно на обикновена лупа, създава увеличено виртуално изображение.
НарастваПриблизителното увеличение на микроскопа може да се определи чрез умножаване на увеличението на обектива по увеличението на окуляра. Увеличението обаче не определя качеството на изображението. Определя се качеството на изображението, неговата яснота резолюция на микроскопа, т.е. способността да се разграничат поотделно две близко разположени точки. Ограничение на разделителната способност- минималното разстояние, на което тези точки все още се виждат поотделно - зависи от дължината на вълната на светлината, с която е осветен обектът и числовата апертура на обектива. Числовата апертура от своя страна зависи от ъгловата апертура на обектива и индекса на пречупване на средата, разположена между предната леща на обектива и образеца. Ъгловата бленда е максималният ъгъл, под който лъчите, преминаващи през обект, могат да влязат в обектива. Колкото по-голям е отворът и колкото по-близо е индексът на пречупване на средата, разположена между лещата и образеца, до индекса на пречупване на стъклото, толкова по-висока е разделителната способност на лещата. Ако приемем, че апертурата на кондензатора е равна на апертурата на лещата, тогава формулата за разделителна способност има следния вид:

където R е границата на разделителната способност; - дължина на вълната; NA - цифрова апертура.

Разграничете полезенИ безполезеннараства. Полезното увеличение обикновено е равно на цифровата апертура на обектива, увеличена от 500 до 1000 пъти. По-голямото очно увеличение не разкрива нови детайли и е безполезно.
В зависимост от средата, която е между обектива и образеца, има "сухи" лещи с малко и средно увеличение (до 40 x) и потапящи лещи с максимална бленда и увеличение (90-100 x). „Сухата“ леща е леща с въздух между предната леща и образеца.

Характеристика на имерсионните лещи е, че между предната леща на такава леща и препарата се поставя имерсионна течност, която има индекс на пречупване като стъклото (или близък до него), което осигурява увеличаване на цифровата апертура и разделителна способност на обектива. Дестилирана вода се използва като течност за потапяне за водопотопяеми лещи, а кедрово масло или специално синтетично потапящо масло се използва за маслени потапящи лещи. Използването на синтетично имерсионно масло е за предпочитане, тъй като неговите параметри са по-точно стандартизирани и за разлика от кедровото масло не изсъхва върху повърхността на предната леща на обектива. За лещи, работещи в ултравиолетовата област на спектъра, глицеринът се използва като течност за потапяне. При никакви обстоятелства не трябва да използвате заместители на маслото за потапяне и по-специално вазелиново масло.
**Изображението, получено с помощта на лещи, има различни недостатъци: сферични и хроматични аберации, кривина на полето на изображението и др. При обективи, състоящи се от няколко лещи, тези недостатъци се коригират в една или друга степен. В зависимост от степента на коригиране на тези недостатъци ахроматните лещи се отличават от по-сложните апохроматни лещи. Съответно лещите, в които се коригира кривината на полето на изображението, се наричат ​​планхромати и планапохромати. Използването на тези лещи създава рязко изображение в цялото зрително поле, докато изображението, получено с конвенционалните лещи, не е еднакво рязко в центъра и по краищата на зрителното поле. Всички характеристики на обектива обикновено са гравирани върху неговата рамка: собствено увеличение, диафрагма, вид на обектива (APO - апохромат и др.); водопотопните лещи имат обозначение VI и бял пръстен около рамката в долната част, маслените потопяеми лещи имат обозначение MI и черен пръстен.
Всички обективи са предназначени за работа с покривно стъкло с дебелина 0,17 мм.
Дебелината на покривното стъкло особено влияе върху качеството на изображението при работа със силни сухи системи (40 x). Когато работите с потапящи се обективи, не можете да използвате покривни стъкла с дебелина над 0,17 mm, тъй като дебелината на покривното стъкло може да е по-голяма от работното разстояние на обектива и в този случай, когато се опитвате да фокусирате обектива върху образеца, предната част лещата на обектива може да се повреди.
Окулярите се състоят от две лещи и се предлагат в няколко вида, всеки от които се използва с определен тип леща, което допълнително елиминира несъвършенствата на изображението. Типът на окуляра и увеличението са отбелязани върху рамката.
Кондензаторът е предназначен да фокусира светлината от осветителя върху образеца, насочена от огледалото на микроскопа или осветителя (в случай на използване на горен или вграден осветител). Една от частите на кондензатора е апертурната диафрагма, която е важна за правилното осветяване на лекарството.
Осветителят се състои от нисковолтова лампа с нажежаема жичка с дебела нишка, трансформатор, колекторна леща и полева диафрагма, чийто отвор определя диаметъра на осветеното поле върху препарата. Огледалото насочва светлината от осветителя към кондензатора. За да се запази паралелността на лъчите, идващи от осветителя към кондензатора, е необходимо да се използва само плоската страна на огледалото.

Настройка на осветлението и фокусиране на микроскопа

Качеството на изображението също до голяма степен зависи от правилното осветление. Има няколко различни начина за осветяване на образец за микроскопия. Най-често срещаният начин е Осветителни инсталации Köhlerкоето е както следва:
1) монтирайте осветителя срещу огледалото на микроскопа;
2) включете лампата на осветителя и насочете светлината към плоското (!) Огледало на микроскопа;
3) поставете препарата върху предмета на микроскопа;
4) покрийте огледалото на микроскопа с лист бяла хартия и фокусирайте изображението на нажежаемата жичка върху него, като преместите гнездото на лампата в осветителя;
5) извадете листа хартия от огледалото;
6) затворете апертурната диафрагма на кондензатора. Чрез преместване на огледалото и леко преместване на фасунгата на лампата, изображението на нажежаемата жичка се фокусира върху апертурната диафрагма. Разстоянието на осветителя от микроскопа трябва да бъде такова, че изображението на нажежаемата жичка на лампата да е равно на диаметъра на апертурната диафрагма на кондензатора (апертурната диафрагма може да се наблюдава с помощта на плоско огледало, поставено от дясната страна на основата на микроскопът).
7) отворете апертурната диафрагма на кондензатора, намалете отвора на полевата диафрагма на осветителя и значително намалете интензитета на лампата;
8) при малко увеличение (10х), гледайки през окуляра, се получава остър образ на препарата;
9) чрез леко завъртане на огледалото изображението на полевата диафрагма, което прилича на светло петно, се прехвърля в центъра на зрителното поле. Чрез спускане и повдигане на кондензатора се постига рязко изображение на ръбовете на полевата диафрагма в равнината на препарата (около тях може да се вижда цветна граница);
10) отворете полевата диафрагма на осветителя до краищата на зрителното поле, увеличете интензитета на нишката на лампата и леко (с 1/3) намалете отварянето на диафрагмата на апертурата на кондензатора;
11) Когато сменяте обективите, трябва да проверите настройките на светлината.
След завършване на регулирането на светлината на Köhler не можете да промените позицията на кондензатора и отвора на диафрагмата на полето и апертурата. Осветяването на лекарството може да се регулира само с неутрални филтри или чрез промяна на интензитета на лампата с помощта на реостат. Прекомерното отваряне на апертурната диафрагма на кондензатора може да доведе до значително намаляване на контраста на изображението, а недостатъчното отваряне може да доведе до значително влошаване на качеството на изображението (поява на дифракционни пръстени). За да проверите правилното отваряне на диафрагмата на апертурата, е необходимо да извадите окуляра и, гледайки в тръбата, да я отворите така, че да покрие светлинното поле с една трета. За правилно осветяване на образеца при работа с лещи с ниско увеличение (до 10x) е необходимо да развиете и отстраните горната събирателна леща.
внимание! Когато работите с обективи, осигуряващи голямо увеличение - със силна суха (40x) и имерсионна (90x) системи, за да не повредите предната леща, при фокусиране използвайте следната техника: гледайки отстрани, свалете обектива с макро завинтете почти докато влезе в контакт с образеца, след това, гледайки окуляра, с помощта на макровинт повдигнете много бавно лещата, докато се появи изображение, и с помощта на микровинт се извършва окончателното фокусиране на микроскопа.

Грижа за микроскоп

Когато работите с микроскоп, не използвайте голяма сила. Не докосвайте повърхностите на лещи, огледала и филтри с пръсти.
За да защитите вътрешните повърхности на лещите, както и призмите на тубуса от прах, винаги трябва да оставяте окуляра в тубуса. Когато почиствате външните повърхности на лещите, трябва да отстраните праха от тях с мека четка, измита в етер. Ако е необходимо, внимателно избършете повърхностите на лещите с добре измита ленена кърпа без сапун или камбрик, леко навлажнена с чист бензин, етер или специална смес за почистване на оптика. Не се препоръчва оптиката на лещата да се избърсва с ксилен, тъй като това може да доведе до нейното разпадане.
От огледала с външно посребряване можете да премахнете прах само като го издухате с гумена крушка. Те не могат да бъдат изтрити. Също така не можете сами да развиете или разглобите лещите - това ще доведе до тяхната повреда. След приключване на работата по микроскопа е необходимо внимателно да се отстрани останалото имерсионно масло от лещата на предния обектив, като се използва методът, посочен по-горе. След това спуснете предметния стол (или кондензатора при микроскопи с фиксиран предмет) и покрийте микроскопа с капак.
За да поддържате външния вид на микроскопа, е необходимо периодично да го избърсвате с мека кърпа, леко напоена с безкиселинен вазелин и след това със суха, мека и чиста кърпа.

В допълнение към конвенционалната светлинна микроскопия, има методи за микроскопия, които позволяват изследването на неоцветени микроорганизми: фазов контраст , тъмно полеИ луминесцентнимикроскопия. За да изследвате микроорганизми и техните структури, чийто размер е по-малък от разделителната способност на светлинен микроскоп, използвайте

Качество на изображениетоопределен резолюция на микроскопа, т.е. минималното разстояние, на което оптиката на микроскопа може да различи поотделно две близко разположени точки. разделителната способност зависи от числовата апертура на обектива, кондензатора и дължината на вълната на светлината, която осветява образеца. Числовата апертура (отвор) зависи от ъгловата апертура и индекса на пречупване на средата, разположена между предната леща на обектива и кондензатора и образеца.

Ъглова бленда на обектива- това е максималният ъгъл (AOB), под който лъчите, преминаващи през препарата, могат да влязат в лещата. Числова апертура на обективаравен на произведението от синуса на половината от ъгловата апертура и индекса на пречупване на средата, разположена между предметното стъкло и предната леща на обектива. N.A. = n sinα където, N.A. - цифрова апертура; n е коефициентът на пречупване на средата между образеца и лещата; sinα е синусът на ъгъл α, равен на половината от ъгъла AOB в диаграмата.

По този начин апертурата на сухите системи (между предната леща на обектива и въздушната подготовка) не може да бъде повече от 1 (обикновено не повече от 0,95). Средата, поставена между образеца и обектива, се нарича потапяща течност или потапяне, а обектив, предназначен да работи с потапяща течност, се нарича потапяне. Благодарение на потапяне с по-висок коефициент на пречупване от въздуха е възможно да се увеличи числовата апертура на лещата и следователно разделителната способност.

Цифровата апертура на обективите винаги е гравирана върху техните рамки.
Разделителната способност на микроскопа зависи и от апертурата на кондензатора. Ако приемем, че апертурата на кондензатора е равна на апертурата на лещата, тогава формулата за разделителна способност има формата R=λ/2NA, където R е границата на разделителната способност; λ - дължина на вълната; N.A - цифрова апертура. От тази формула става ясно, че когато се наблюдава във видима светлина (зелена част от спектъра - λ = 550 nm), разделителната способност (граница на разделителната способност) не може да бъде > 0,2 µm

Влиянието на цифровата апертура на обектива на микроскопа върху качеството на изображението

Начини за увеличаване на оптичната разделителна способност

Избор на голям ъгъл на светлинния конус, както от страната на обектива, така и от страната на светлинния източник. Благодарение на това е възможно да се съберат повече пречупени лъчи светлина от много тънки структури в лещата. Следователно, първият начин за увеличаване на разделителната способност е да се използва кондензатор, чиято числова апертура съвпада с числовата апертура на обектива.

Вторият метод е да се използва течност за потапяне между предната леща на обектива и покривното стъкло. Така влияем върху показателя на пречупване на средата n, описан в първата формула. Оптималната му стойност, препоръчана за течности за потапяне, е 1,51.

Течности за потапяне

Течности за потапянеса необходими за увеличаване на цифровата апертура и съответно за увеличаване на разделителната способност на потапящи се обективи, специално проектирани за работа с тези течности и съответно маркирани. Течностите за потапяне, поставени между обектива и образеца, имат по-висок индекс на пречупване от въздуха. Следователно светлинните лъчи, отклонени от най-малките детайли на обекта, не се разпръскват при напускане на препарата и влизат в обектива, което води до увеличаване на разделителната способност.

Има водопотопяеми лещи (маркирани с бял пръстен), маслопотопяеми лещи (черен пръстен), глицеринови потапящи лещи (жълт пръстен) и монобромнафталенови потапящи лещи (червен пръстен). При светлинна микроскопия на биологични препарати се използват водни и маслени имерсионни обективи. Специални кварцови глицеринови имерсионни обективи предават късовълнова ултравиолетова радиация и са предназначени за ултравиолетова (да не се бърка с флуоресцентна) микроскопия (т.е. за изследване на биологични обекти, които избирателно абсорбират ултравиолетови лъчи). Имерсионни обективи от монобромиран нафталин не се използват при микроскопия на биологични обекти.

Дестилирана вода се използва като течност за потапяне за водопотопяеми лещи, а естествено (кедрово) или синтетично масло с определен индекс на пречупване се използва като течност за потапяне за маслени лещи.

За разлика от други течности за потапяне маслено потапянее хомогенен, защото има индекс на пречупване, равен или много близък до индекса на пречупване на стъклото. Обикновено този индекс на пречупване (n) се изчислява за конкретна спектрална линия и конкретна температура и е посочен върху бутилката с масло. Например индексът на пречупване на имерсионно масло за работа с покривно стъкло за спектрална линия D в натриевия спектър при температура = 20°C е 1,515 (nD 20 = 1,515), за работа без покривно стъкло (nD 20 = 1,520) ).

За работа с апохроматични лещи се нормализира и дисперсията, т.е. разликата в показателите на пречупване за различните линии на спектъра.

Използването на синтетично имерсионно масло е за предпочитане, тъй като неговите параметри са по-точно стандартизирани и за разлика от кедровото масло не изсъхва върху повърхността на предната леща на обектива.

Като се има предвид горното, в никакъв случай не трябва да използвате заместители на маслото за потапяне и по-специално вазелиново масло. При някои методи на микроскопия, за да се увеличи апертурата на кондензатора, между кондензатора и образеца се поставя течност за потапяне (обикновено дестилирана вода).