Wzór na rozdzielczość mikroskopu. Powiększenie mikroskopu. Rozdzielczość mikroskopu

Mikroskop przeznaczony jest do obserwacji małych obiektów przy większym powiększeniu i rozdzielczości większej niż zapewnia szkło powiększające. Układ optyczny mikroskopu składa się z dwóch części: soczewki i okularu. Soczewka mikroskopu tworzy prawdziwie powiększony odwrócony obraz obiektu w przedniej płaszczyźnie ogniskowej okularu. Okular działa jak szkło powiększające i tworzy wirtualny obraz w najlepszej odległości widzenia. W stosunku do całego mikroskopu badany obiekt położony jest w przedniej płaszczyźnie ogniskowej.

Powiększenie mikroskopu

Działanie mikrosoczewki charakteryzuje się jej liniowym powiększeniem: V ob = -Δ/F\" ob * F\" ob - ogniskowa mikrosoczewki * Δ - odległość pomiędzy tylnym ogniskiem soczewki a przednim ogniskiem soczewki okular, zwany interwałem optycznym lub długością optyczną tubusu.

Obraz wytwarzany przez obiektyw mikroskopu w przedniej płaszczyźnie ogniskowej okularu oglądany jest przez okular, który pełni funkcję szkła powiększającego o widocznym powiększeniu:

G ok = ¼ F ok

Całkowite powiększenie mikroskopu określa się jako iloczyn powiększenia obiektywu i powiększenia okularu: G=V około *G około

Jeżeli znana jest ogniskowa całego mikroskopu, to jego powiększenie pozorne można wyznaczyć w taki sam sposób, jak w przypadku szkła powiększającego:

Z reguły powiększenie współczesnych soczewek mikroskopowych jest ujednolicone i wynosi szereg liczb: 10, 20, 40, 60, 90, 100 razy. Powiększenia okularu również mają bardzo specyficzne wartości, na przykład 10, 20, 30 razy. Wszystkie nowoczesne mikroskopy mają zestaw obiektywów i okularów, które zostały specjalnie zaprojektowane i wyprodukowane tak, aby pasowały do ​​siebie, dzięki czemu można je łączyć w celu uzyskania różnych powiększeń.

Pole widzenia mikroskopu

Pole widzenia mikroskopu zależy od pola kątowego okularu ω , w ramach którego uzyskuje się obraz w miarę dobrej jakości: 2y=500*tg(ω)/G * G - powiększenie mikroskopu

Dla danego pola kątowego okularu pole liniowe mikroskopu w przestrzeni obiektu jest tym mniejsze, im większe jest jego powiększenie pozorne.

Średnica źrenicy wyjściowej mikroskopu

Średnicę źrenicy wyjściowej mikroskopu oblicza się w następujący sposób:
gdzie A jest przednią aperturą mikroskopu.

Średnica źrenicy wyjściowej mikroskopu jest zwykle nieco mniejsza niż średnica źrenicy oka (0,5 - 1 mm).

Podczas obserwacji przez mikroskop źrenica oka musi znajdować się w jednej linii ze źrenicą wyjściową mikroskopu.

Rozdzielczość mikroskopu

Jedną z najważniejszych cech mikroskopu jest jego rozdzielczość. Zgodnie z teorią dyfrakcji Abbego granica rozdzielczości liniowej mikroskopu, to znaczy minimalna odległość między punktami obiektu, które są obrazowane jako oddzielne, zależy od długości fali i apertury numerycznej mikroskopu:
Maksymalną osiągalną rozdzielczość mikroskopu optycznego można obliczyć na podstawie wyrażenia na aperturę mikroskopu. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że maksymalna możliwa wartość sinusa kąta wynosi jedność, to dla średniej długości fali możemy obliczyć rozdzielczość mikroskopu:

Istnieją dwa sposoby zwiększenia rozdzielczości mikroskopu: * Zwiększając aperturę obiektywu, * Zmniejszając długość fali światła.

Zanurzenie

W celu zwiększenia apertury soczewki przestrzeń pomiędzy badanym przedmiotem a soczewką wypełnia się tzw. cieczą immersyjną – przezroczystą substancją o współczynniku załamania światła większym niż jeden. Jako taką ciecz stosuje się wodę, olej cedrowy, roztwór gliceryny i inne substancje. Apertury obiektywów immersyjnych o dużym powiększeniu osiągają wartość , wtedy będzie to maksymalna osiągalna rozdzielczość immersyjnego mikroskopu optycznego.

Zastosowanie promieni ultrafioletowych

Aby zwiększyć rozdzielczość mikroskopu, druga metoda wykorzystuje promienie ultrafioletowe, których długość fali jest krótsza niż długość promieni widzialnych. W takim przypadku należy zastosować specjalną optykę, która jest przezroczysta dla światła ultrafioletowego. Ponieważ oko ludzkie nie odbiera promieniowania ultrafioletowego, należy albo zastosować środki przekształcające niewidzialny obraz ultrafioletowy w widzialny, albo sfotografować obraz w promieniach ultrafioletowych. Przy długości fali rozdzielczość mikroskopu będzie wynosić.

Oprócz zwiększonej rozdzielczości metoda obserwacji w świetle ultrafioletowym ma inne zalety. Zazwyczaj żywe obiekty są przezroczyste w widzialnym obszarze widma i dlatego przed obserwacją są wstępnie barwione. Ale niektóre obiekty (kwasy nukleinowe, białka) mają selektywną absorpcję w ultrafioletowym obszarze widma, dzięki czemu mogą być „widoczne” w świetle ultrafioletowym bez barwienia.

2. Układ optyczny mikroskopu.

3. Powiększenie mikroskopu.

4. Limit rozdzielczości. Moc rozdzielcza mikroskopu.

5. Przydatne powiększenie mikroskopu.

6. Specjalne techniki mikroskopii.

7. Podstawowe pojęcia i wzory.

8. Zadania.

Zdolność oka do rozróżniania drobnych szczegółów obiektu zależy od wielkości obrazu na siatkówce lub od kąta widzenia. Aby zwiększyć kąt widzenia, stosuje się specjalne urządzenia optyczne.

25.1. Lupa

Najprostszym urządzeniem optycznym zwiększającym kąt widzenia jest szkło powiększające, czyli soczewka skupiająca o krótkim ogniskowaniu (f=1-10 cm).

Przedmiot, o którym mowa, umieszcza się pomiędzy lupą a jej frontem centrum w taki sposób, aby jego wirtualny obraz mieścił się w granicach akomodacji dla danego oka. Zwykle korzysta się z samolotów dalekiego lub bliskiego zakwaterowania. Ten drugi przypadek jest lepszy, ponieważ oko nie męczy się (mięsień pierścieniowy nie jest napięty).

Porównajmy kąty widzenia, pod którymi obiekt jest widoczny, oglądany „nago” normalna okiem i szkłem powiększającym. Obliczenia wykonamy dla przypadku, gdy otrzymamy wirtualny obraz obiektu w nieskończoności (dalekiej granicy akomodacji).

Oglądając obiekt gołym okiem (ryc. 25.1, a), aby uzyskać maksymalny kąt widzenia, obiekt należy umieścić w odległości najlepszego widzenia a 0. Kąt widzenia, pod jakim obiekt jest widziany, jest równy β = B/a 0 (B to rozmiar obiektu).

Oglądając obiekt przez szkło powiększające (ryc. 25.1, b), umieszcza się go w przedniej płaszczyźnie ogniskowej szkła powiększającego. W tym przypadku oko widzi wyimaginowany obraz obiektu B", znajdującego się w nieskończenie odległej płaszczyźnie. Kąt widzenia, pod którym obraz jest widoczny, wynosi β" ≈ B/f.

Ryż. 25.1. Kąty widzenia: A- gołym okiem; B- przy użyciu szkła powiększającego: f - ogniskowa szkła powiększającego; N - punkt węzłowy oka

Szkło powiększające- współczynnik kąta widzeniaβ", pod którym widać obraz obiektu w lupie, pod kątem widzeniaβ, pod którym obiekt jest widoczny „gołym” normalnym okiem z odległości najlepszego widzenia:

Powiększenia powiększeń są różne dla oczu krótkowzrocznych i dalekowzrocznych, ponieważ mają różną odległość najlepszego widzenia.

Przedstawmy bez wyprowadzenia wzór na powiększenie, jakie daje szkło powiększające stosowane przez oko krótkowzroczne lub dalekowzroczne podczas tworzenia obrazu w płaszczyźnie dalekiego akomodacji:

gdzie odległość jest najdalszą granicą zakwaterowania.

Ze wzoru (25,1) wynika, że ​​zmniejszając ogniskową lupy można uzyskać dowolnie duże powiększenie. W zasadzie jest to prawdą. Kiedy jednak ogniskowa lupy zostanie zmniejszona, a jej rozmiar pozostanie taki sam, powstają aberracje, które niwelują cały efekt powiększenia. Dlatego lupy jednosoczewkowe mają zwykle powiększenie 5-7x.

Aby zredukować aberracje, wykonuje się złożone lupy składające się z dwóch lub trzech soczewek. W takim przypadku możliwe jest osiągnięcie 50-krotnego wzrostu.

25.2. Układ optyczny mikroskopu

Większe powiększenie można uzyskać oglądając przez szkło powiększające rzeczywisty obraz obiektu utworzony przez inną soczewkę lub układ soczewek. Takie urządzenie optyczne jest realizowane w mikroskopie. W tym przypadku nazywa się szkło powiększające okular, i drugi obiektyw - obiektyw.Ścieżkę promieni w mikroskopie pokazano na ryc. 25.2.

Obiekt B ustawia się w pobliżu przedniego ogniska soczewki (F około) w taki sposób, aby jego rzeczywisty, powiększony obraz B" znajdował się pomiędzy okularem a jego przednim ogniskiem. Kiedy

Ryż. 25.2. Droga promieni w mikroskopie.

W tym przypadku okular daje wyimaginowany powiększony obraz B”, który jest oglądany przez oko.

Zmieniając odległość przedmiotu od soczewki, zapewniamy, że obraz B" znajduje się w płaszczyźnie dalekiego zakwaterowania oka (w tym przypadku oko nie ulega zmęczeniu). Dla osoby prawidłowo widzącej B" jest znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej okularu, a B” uzyskuje się w nieskończoności.

25.3. Powiększenie mikroskopu

Główną cechą mikroskopu jest jego kątowość zwiększyć. Koncepcja ta jest podobna do powiększenia kątowego szkła powiększającego.

Powiększenie mikroskopu- współczynnik kąta widzeniaβ", pod którym widać obraz obiektu okular, do kąta widzeniaβ, pod którym obiekt jest widoczny „gołym” okiem z odległości najlepszego widzenia (a 0):

25.4. Limit rozdzielczości. Rozdzielczość mikroskopu

Można odnieść wrażenie, że zwiększając długość optyczną tubusu można uzyskać dowolnie duże powiększenie i dzięki temu zbadać najdrobniejsze szczegóły obiektu.

Uwzględnienie jednak falowych właściwości światła pokazuje, że wielkość drobnych szczegółów dostrzegalnych za pomocą mikroskopu podlega ograniczeniom związanym z dyfrakcjaświatło przechodzące przez otwór soczewki. Ze względu na dyfrakcję obraz oświetlonego punktu nie jest punktem, ale małe jasne kółko. Jeśli części (punkty) rozważanego obiektu znajdują się wystarczająco daleko, soczewka da ich obrazy w postaci dwóch oddzielnych okręgów i będzie można je rozróżnić (ryc. 25.3, a). Najmniejsza odległość między rozróżnialnymi punktami odpowiada „dotykaniu” okręgów (ryc. 25.3, b). Jeśli punkty znajdują się bardzo blisko, odpowiednie „okręgi” nakładają się na siebie i są postrzegane jako jeden obiekt (ryc. 25.3, c).

Ryż. 25.3. Rezolucja

Główną cechą pokazującą możliwości mikroskopu w tym zakresie jest limit rozdzielczości.

Limit rozdzielczości mikroskop (Z) - najmniejsza odległość między dwoma punktami obiektu, przy której można je rozróżnić jako odrębne obiekty (tj. postrzegać w mikroskopie jako dwa punkty).

Nazywa się odwrotnością granicy rozdzielczości rezolucja. Im niższy limit rozdzielczości, tym większa rozdzielczość.

Teoretyczna granica rozdzielczości mikroskopu zależy od długości fali światła użytego do oświetlenia i od otwór kątowy obiektyw.

Otwór kątowy(ty) - kąt pomiędzy skrajnymi promieniami wiązki światła wpadającej do soczewki obiektywu z obiektu.

Wskażmy bez wyprowadzania wzór na granicę rozdzielczości mikroskopu w powietrzu:

Gdzie λ - długość fali światła oświetlającego obiekt.

Nowoczesne mikroskopy mają aperturę kątową do 140°. Jeśli zaakceptujemy λ = 0,555 µm, wówczas dla granicy rozdzielczości otrzymujemy wartość Z = 0,3 µm.

25,5. Przydatne powiększenie mikroskopu

Przekonajmy się, jak duże powinno być powiększenie mikroskopu dla danej granicy rozdzielczości jego obiektywu. Weźmy pod uwagę, że oko ma swoją granicę rozdzielczości, wyznaczoną budową siatkówki. W wykładzie 24 uzyskaliśmy następujące oszacowanie dla granica rozdzielczości oka: ZGL = 145-290 µm. Aby oko mogło rozróżnić te same punkty, które dzieli mikroskop, konieczne jest powiększenie.

Wzrost ten nazywa się użyteczny wzrost.

Należy pamiętać, że przy fotografowaniu obiektu za pomocą mikroskopu według wzoru (25.4) zamiast Z GL należy zastosować granicę rozdzielczości kliszy Z PL.

Przydatne powiększenie mikroskopu- powiększenie, przy którym obiekt mający wielkość równą granicy rozdzielczości mikroskopu daje obraz o wielkości równej granicy rozdzielczości oka.

Korzystając z oszacowania uzyskanego powyżej dla granicy rozdzielczości mikroskopu Z m ≈0,3 µm), znajdujemy: G p ~500-1000.

Nie ma sensu osiągać większego powiększenia dla mikroskopu, bo i tak nie będą widoczne żadne dodatkowe szczegóły.

Przydatne powiększenie mikroskopu - jest to rozsądna kombinacja zdolności rozdzielczych mikroskopu i oka.

25.6. Specjalne techniki mikroskopowe

Aby zwiększyć zdolność rozdzielczą (zmniejszając granicę rozdzielczości) mikroskopu, stosuje się specjalne techniki mikroskopowe.

1. Zanurzenie. W niektórych mikroskopach w celu zmniejszenia limit rozdzielczości przestrzeń pomiędzy soczewką a przedmiotem wypełniona jest specjalnym płynem - zanurzenie. Ten mikroskop nazywa się zanurzenie Efektem zanurzenia jest zmniejszenie długości fali: λ = λ 0 /n, gdzie λ 0 - długość fali światła w próżni, a n to współczynnik załamania światła w zanurzeniu. W tym przypadku granicę rozdzielczości mikroskopu określa następujący wzór (uogólnienie wzoru (25.3)):

Należy pamiętać, że do mikroskopów zanurzeniowych tworzone są specjalne soczewki, ponieważ ogniskowa soczewki zmienia się w ciekłym ośrodku.

2. Mikroskopia UV. Do zmniejszania limit rozdzielczości Wykorzystują krótkofalowe promieniowanie ultrafioletowe, niewidoczne dla oka. W mikroskopach ultrafioletowych mikroobiekt bada się w promieniach UV (w tym przypadku soczewki wykonane są ze szkła kwarcowego, a rejestracja odbywa się na kliszy fotograficznej lub na specjalnym ekranie fluorescencyjnym).

3. Pomiar wielkości mikroskopijnych obiektów. Za pomocą mikroskopu można określić wielkość obserwowanego obiektu. Wykorzystuje się do tego mikrometr okularowy. Najprostszym mikrometrem okularowym jest okrągła szklana płytka, na której naniesiona jest skala. Mikrometr instaluje się w płaszczyźnie obrazu uzyskiwanego z soczewki. Patrząc przez okular, obrazy obiektu i skali łączą się i można obliczyć, która odległość na skali odpowiada zmierzonej wartości. Cena podziału mikrometru ocznego jest wstępnie ustalana na podstawie znanego obiektu.

4. Mikroprojekcja i mikrofotografia. Za pomocą mikroskopu można nie tylko obserwować obiekt przez okular, ale także go sfotografować lub wyświetlić na ekranie. W tym przypadku stosuje się specjalne okulary, które wyświetlają obraz pośredni A"B" na kliszy lub ekranie.

5. Ultramikroskopia. Mikroskop może wykryć cząstki, których rozmiary przekraczają jego rozdzielczość. Metoda ta wykorzystuje oświetlenie skośne, dzięki czemu mikrocząstki są widoczne w postaci jasnych punktów na ciemnym tle, natomiast struktury cząstek nie widać, można jedynie ustalić fakt ich obecności.

Teoria pokazuje, że niezależnie od tego, jak potężny jest mikroskop, każdy obiekt mniejszy niż 3 mikrony będzie w nim reprezentowany po prostu jako jeden punkt, bez żadnych szczegółów. Nie oznacza to jednak, że takich cząstek nie można zobaczyć, można monitorować ich ruchy czy policzyć.

Aby obserwować cząstki, których rozmiary są mniejsze niż granica rozdzielczości mikroskopu, stosuje się urządzenie tzw ultramikroskop. Główną częścią ultramikroskopu jest silne urządzenie oświetleniowe; Oświetlone w ten sposób cząstki obserwuje się w zwykłym mikroskopie. Ultramikroskopia opiera się na fakcie, że małe cząstki zawieszone w cieczy lub gazie stają się widoczne pod silnym bocznym oświetleniem (pomyśl o cząstkach pyłu widocznych w promieniu słońca).

25.8. Podstawowe pojęcia i wzory

Koniec stołu

25.8. Zadania

1. Jako obiektyw mikroskopu stosuje się soczewkę o ogniskowej 0,8 cm, której ogniskowa okularu wynosi 2 cm. Długość optyczna tubusu wynosi 18 cm. Jakie jest powiększenie mikroskopu?

2. Wyznacz granicę rozdzielczości obiektywów suchych i immersyjnych (n = 1,55) o aperturze kątowej u = 140 o. Przyjmij długość fali wynoszącą 0,555 µm.

3. Jaka jest granica rozdzielczości przy długości fali? λ = 0,555 µm, jeżeli apertura numeryczna wynosi: A 1 = 0,25, A 2 = 0,65?

4. Jakiego współczynnika załamania światła należy użyć cieczy immersyjnej, aby oglądać pod mikroskopem element subkomórkowy o średnicy 0,25 μm przez pomarańczowy filtr (długość fali 600 nm)? Kąt apertury mikroskopu wynosi 70°.

5. Na krawędzi lupy znajduje się napis „x10”. Określ ogniskową tej lupy.

6. Ogniskowa soczewki mikroskopu f 1 = 0,3 cm, długość tubusu Δ = 15 cm, powiększenie Г = 2500. Znajdź ogniskową F 2 okularu. Najlepsza odległość widzenia to 0 = 25 cm.

Rozbudowa systemu– ważny czynnik, który opiera się na wyborze tego lub innego mikroskopu, w zależności od rozwiązania niezbędnych problemów. Wszyscy jesteśmy przyzwyczajeni do tego, że elementy półprzewodnikowe trzeba badać pod mikroskopem inspekcyjnym o powiększeniu 1000x i większym, owady możemy badać pracując pod mikroskopem stereoskopowym o powiększeniu 50x, a także badaliśmy łuski cebuli barwione jodem lub brylantem zielony, w szkole pod mikroskopem jednoocznym, kiedy pojęcie powiększenia nie było nam jeszcze znane.

Jak jednak interpretować pojęcie powiększenia, gdy mamy przed sobą mikroskop cyfrowy lub konfokalny, a soczewki mają wartości 2000x, 5000x? Co to oznacza, czy powiększenie 1000x w mikroskopie optycznym da obraz podobny do mikroskopu cyfrowego 1000x? Dowiesz się o tym w tym artykule.

System zoomu optycznego

Kiedy pracujemy z mikroskopem laboratoryjnym lub stereoskopowym, obliczenie aktualnego powiększenia układu nie jest trudne. Konieczne jest pomnożenie powiększenia wszystkich elementów optycznych systemu. Zwykle w przypadku mikroskopu stereoskopowego obejmuje to soczewkę obiektywową, soczewkę zmiennoogniskową lub bęben powiększający oraz okulary.
W przypadku konwencjonalnego mikroskopu laboratoryjnego sytuacja jest jeszcze prostsza - całkowite powiększenie układu = powiększenie okularów pomnożone przez powiększenie soczewki zamontowanej w pozycji roboczej. Należy pamiętać, że czasami istnieją specyficzne modele tubusów mikroskopowych, które mają współczynnik powiększenia lub zmniejszenia (szczególnie powszechne w przypadku starszych modeli mikroskopów Leitz). Również dodatkowe elementy optyczne, czy to współosiowe źródło oświetlenia w mikroskopie stereoskopowym, czy pośredni adapter kamery umieszczony pod tubusem, mogą mieć dodatkowy współczynnik powiększenia.

Dodatkowe elementy optyczne mają czasami swój własny współczynnik powiększenia inny niż 1. W tym przypadku współosiowy oświetlacz (poz. 2) stereomikroskopu Olympus SZX16 ma dodatkowy współczynnik powiększenia 1,5x.

Na przykład mikroskop stereoskopowy z okularami 10x, obiektywem 2x, soczewką zmiennoogniskową 8x i współosiowym modułem oświetlenia o współczynniku 1,5x będzie miał całkowite powiększenie optyczne wynoszące 10x2x8x1,5 = 240x.

Schematyczny diagram akwizycji obrazu za pomocą mikroskopu świetlnego. Okular powiększa obraz tworzony przez soczewkę i tworzy obraz wirtualny.

W tym przypadku przez powiększenie optyczne (G) należy rozumieć stosunek tangensa kąta nachylenia wiązki wychodzącej z układu optycznego do przestrzeni obrazu do tangensa kąta sprzężenia z nią wiązki w przestrzeni obiekty. Lub stosunek długości obrazu odcinka utworzonego przez układ optyczny, prostopadłego do osi układu optycznego, do długości samego odcinka

Powiększenie układu geometrycznego

W przypadku, gdy układ nie posiada okularów, a powiększony obraz tworzony jest przez kamerę na ekranie monitora, np. jak w mikroskopie, należy przejść do określenia powiększenia geometrycznego układu optycznego.
Powiększenie geometryczne mikroskopu to stosunek liniowego rozmiaru obrazu obiektu na monitorze do rzeczywistego rozmiaru badanego obiektu.
Wartość powiększenia geometrycznego można uzyskać mnożąc następujące wartości: powiększenie optyczne obiektywu, powiększenie optyczne adaptera aparatu, stosunek przekątnej monitora do przekątnej matrycy aparatu.
Przykładowo pracując na mikroskopie laboratoryjnym z obiektywem 50x, adapterem do aparatu 0,5x, kamerą 1/2,5” i wyświetlając obraz na monitorze laptopa 14” otrzymamy powiększenie układu geometrycznego = 50x0,5x(14 /0,4) = 875x.
Chociaż powiększenie optyczne w przypadku okularów 10x będzie równe 500x.

Mikroskopy cyfrowe, profilometry konfokalne, mikroskopy elektronowe i inne systemy tworzące cyfrowy obraz obiektu na ekranie monitora działają w oparciu o koncepcję powiększenia geometrycznego. Pojęcia tego nie należy mylić z zoomem optycznym.

Rozdzielczość mikroskopu

Panuje powszechne błędne przekonanie, że rozdzielczość mikroskopu i jego powiększenie są ze sobą ściśle powiązane – im większe powiększenie, tym mniejsze obiekty możemy przez niego zobaczyć. To nie jest prawda. Najważniejszym czynnikiem jest zawsze pozwolenie system optyczny. Przecież powiększenie nierozdzielonego obrazu nie da nam nowych informacji na jego temat.

Rozdzielczość mikroskopu zależy od wartości liczbowej apertury obiektywu, a także od długości fali źródła światła. Jak widać w tej formule nie ma parametru zwiększania systemowego.

gdzie λ to średnia długość fali źródła światła, NA to apertura numeryczna soczewki, R to rozdzielczość układu optycznego.

Stosując obiektyw NA 0,95 pod mikroskopem laboratoryjnym ze źródłem halogenu (średnia długość fali ok. 500 nm) uzyskujemy rozdzielczość ok. 300 nm.

Jak widać na schemacie obwodu mikroskopu świetlnego, okulary powiększają rzeczywisty obraz obiektu. Jeśli np. zwiększymy współczynnik powiększenia okularów 2-krotnie (włóżmy do mikroskopu okulary 20x), to całkowite powiększenie układu podwoi się, ale rozdzielczość pozostanie taka sama.

Ważna uwaga

Załóżmy, że mamy dwie możliwości zbudowania prostego mikroskopu laboratoryjnego. Pierwszy zbudujemy z obiektywem 40x NA 0.65 i okularami 10x. Drugi będzie korzystał z obiektywu 20x NA 0,4 i okularów 20x.

Powiększenie mikroskopów w obu wersjach będzie takie samo= 400x (proste pomnożenie powiększenia obiektywu i okularu). I tu rozdzielczość w pierwszej wersji będzie wyższa, niż w drugim, ponieważ apertura numeryczna obiektywu 40x jest większa. Poza tym nie zapomnij o polu widzenia okularów, dla 20x parametr ten jest o 20-25% niższy.

Mikroskopy służą do wykrywania i badania mikroorganizmów. Mikroskopy świetlne przeznaczone są do badania mikroorganizmów o wielkości co najmniej 0,2 mikrona (bakterie, pierwotniaki itp.), natomiast mikroskopy elektroniczne służą do badania mniejszych mikroorganizmów (wirusów) i najmniejszych struktur bakterii.
Nowoczesny mikroskopy świetlne- są to skomplikowane przyrządy optyczne, których obsługa wymaga pewnej wiedzy, umiejętności i dużej staranności.
Mikroskopy świetlne dzielą się na studenckie, robocze, laboratoryjne i badawcze, różniące się konstrukcją i optyką. Mikroskopy domowe (Biolam, Bimam, Mikmed) mają oznaczenia wskazujące, do której grupy należą (S - studenckie, R - robotnicze, L - laboratoryjne, I - badawcze), wyposażenie jest oznaczone liczbą.

Mikroskop składa się z części mechanicznych i optycznych.
DO część mechaniczna w skład których wchodzą: statyw (składający się z podstawy i uchwytu na tubus) oraz zamontowana na nim tubus z rewolwerem do mocowania i wymiany obiektywów, stolik do preparacji, urządzenia do mocowania kondensora i filtrów świetlnych, a także mechanizmy wbudowane w statyw do zdjęć zgrubnych (makromechanizm, makrośruba) i drobnych
(mikromechanizm, mikrośruba) przesuwanie stolika przedmiotowego lub uchwytu lampy.
Część optyczna Mikroskop reprezentują obiektywy, okulary oraz system oświetlenia, który z kolei składa się z kondensora Abbego umieszczonego pod stolikiem, lustra o płaskiej i wklęsłej stronie oraz oddzielnego lub wbudowanego oświetlacza. Do rewolweru wkręca się soczewki, a po przeciwnej stronie tubusu instaluje się odpowiedni okular, przez który obserwuje się obraz. Wyróżnia się tubusy monokularowe (z jednym okularem) i binokularowe (z dwoma identycznymi okularami).

Schemat ideowy mikroskopu i systemu oświetleniowego

1. Źródło światła;
2. Kolekcjoner;
3. Przesłona polowa irysowa;
4. Lustro;
5. Przysłona irysowa;
6. Skraplacz;
7. Lek;
7". Powiększony rzeczywisty obraz pośredni preparatu, utworzony przez: soczewkę;
7"". Powiększony wirtualny obraz końcowy próbki widzianej przez okular;
8. Soczewka;
9. Ikona wyjścia obiektywu;
10. Przysłona polowa okularu;
11. Okular;
12. Oko.

Główną rolę w uzyskaniu obrazu odgrywają obiektyw. Buduje powiększony, rzeczywisty i odwrócony obraz obiektu. Obraz ten jest następnie dodatkowo powiększany podczas oglądania przez okular, który podobnie jak zwykłe szkło powiększające tworzy powiększony obraz wirtualny.
Zwiększyć Przybliżone powiększenie mikroskopu można wyznaczyć mnożąc powiększenie obiektywu przez powiększenie okularu. Jednakże powiększenie nie decyduje o jakości obrazu. Określa się jakość obrazu, jego klarowność rozdzielczość mikroskopu, czyli możliwość osobnego rozróżnienia dwóch blisko położonych punktów. Limit rozdzielczości- minimalna odległość, przy której te punkty są jeszcze osobno widoczne - zależy od długości fali światła, jakim oświetlany jest obiekt oraz apertury numerycznej obiektywu. Z kolei apertura numeryczna zależy od apertury kątowej obiektywu i współczynnika załamania światła ośrodka znajdującego się pomiędzy przednią soczewką obiektywu a preparatem. Apertura kątowa to maksymalny kąt, pod jakim promienie przechodzące przez obiekt mogą dostać się do soczewki. Im większa apertura i im współczynnik załamania światła ośrodka znajdującego się pomiędzy soczewką a próbką jest bliższy współczynnikowi załamania światła szkła, tym większa jest zdolność rozdzielcza soczewki. Jeżeli założymy, że apertura kondensora jest równa aperturze obiektywu, to wzór na rozdzielczość ma postać:

gdzie R jest granicą rozdzielczości; - długość fali; NA - apertura numeryczna.

Wyróżnić użyteczne I bezużyteczny zwiększyć. Przydatne powiększenie jest zwykle równe aperturze numerycznej obiektywu powiększonej od 500 do 1000 razy. Większe powiększenie oka nie ujawnia nowych szczegółów i jest bezużyteczne.
W zależności od środowiska pomiędzy soczewką a preparatem wyróżnia się soczewki „suche” o małym i średnim powiększeniu (do 40x) oraz soczewki immersyjne o maksymalnej aperturze i powiększeniu (90-100x). Soczewka „sucha” to soczewka, w której pomiędzy przednią soczewką a preparatem znajduje się powietrze.

Cechą soczewek immersyjnych jest to, że pomiędzy przednią soczewką takiej soczewki a preparatem umieszczona jest ciecz immersyjna, której współczynnik załamania światła jest taki sam jak szkło (lub zbliżony do niego), co zapewnia zwiększenie apertury numerycznej i rozdzielczość obiektywu. Jako płyn immersyjny do soczewek immersyjnych stosuje się wodę destylowaną, a do soczewek olejkowych immersyjnych stosuje się olej cedrowy lub specjalny syntetyczny olejek immersyjny. Preferowane jest stosowanie syntetycznego olejku immersyjnego, ponieważ jego parametry są dokładniej ustandaryzowane i w przeciwieństwie do olejku cedrowego nie wysycha na powierzchni przedniej soczewki obiektywu. W przypadku soczewek działających w ultrafioletowym obszarze widma jako płyn immersyjny stosuje się glicerynę. W żadnym wypadku nie należy stosować zamienników olejku immersyjnego, a w szczególności olejku wazelinowego.
**Obraz uzyskany przy użyciu obiektywów ma różne wady: aberracje sferyczne i chromatyczne, krzywiznę pola obrazowego itp. W obiektywach składających się z kilku soczewek wady te są w mniejszym lub większym stopniu korygowane. W zależności od stopnia skorygowania tych wad, soczewki achromatyczne odróżnia się od bardziej złożonych soczewek apochromatycznych. Odpowiednio soczewki, w których korygowana jest krzywizna pola obrazu, nazywane są planochromatami i planapochromatami. Stosowanie tych obiektywów pozwala uzyskać ostry obraz w całym polu widzenia, podczas gdy obraz uzyskany przy użyciu konwencjonalnych obiektywów nie jest tak ostry w centrum i na brzegach pola widzenia. Wszystkie cechy obiektywu są zwykle wygrawerowane na jego oprawce: własne powiększenie, przysłona, typ obiektywu (APO - apochromat itp.); soczewki wodne mają oznaczenie VI i biały pierścień wokół oprawki w dolnej części, soczewki olejkowe mają oznaczenie MI i czarny pierścień.
Wszystkie obiektywy przystosowane są do współpracy ze szkłem osłonowym o grubości 0,17mm.
Grubość szkiełka nakrywkowego szczególnie wpływa na jakość obrazu podczas pracy z mocnymi, suchymi systemami (40 x). Przy pracy z obiektywami immersyjnymi nie można stosować szkiełek nakrywkowych o grubości większej niż 0,17 mm, ponieważ grubość szkiełka nakrywkowego może być większa niż odległość robocza obiektywu i w tym przypadku przy próbie skupienia obiektywu na preparacie przednia soczewka obiektywu może zostać uszkodzona.
Okulary składają się z dwóch soczewek i są dostępne w kilku typach, z których każdy jest używany z określonym typem soczewki, co dodatkowo eliminuje niedoskonałości obrazu. Typ okularu i powiększenie są zaznaczone na oprawce.
Kondensator przeznaczony jest do skupiania światła z oświetlacza na preparacie, kierowanego przez zwierciadło mikroskopu lub oświetlacza (w przypadku stosowania oświetlacza górnego lub wbudowanego). Jedną z części kondensora jest przysłona aperturowa, która ma znaczenie dla prawidłowego oświetlenia leku.
Oświetlacz składa się z żarówki niskonapięciowej z grubym żarnikiem, transformatora, soczewki kolektora oraz przysłony polowej, której otwór określa średnicę oświetlanego pola na preparacie. Lustro kieruje światło z oświetlacza do kondensatora. Aby zachować równoległość promieni dochodzących z oświetlacza do kondensora, należy stosować wyłącznie płaską stronę lustra.

Ustawianie oświetlenia i ogniskowanie mikroskopu

Jakość obrazu w dużej mierze zależy także od prawidłowego oświetlenia. Istnieje kilka różnych sposobów oświetlania próbki do mikroskopii. Najczęstszym sposobem jest Instalacje oświetleniowe firmy Köhler co jest następujące:
1) zamontować oświetlacz przy zwierciadle mikroskopu;
2) włączyć lampę oświetlającą i skierować światło na płaskie (!) lustro mikroskopu;
3) umieścić preparat na stoliku mikroskopowym;
4) przykryć zwierciadło mikroskopu kawałkiem białego papieru i skupić na nim obraz żarnika lampy, przesuwając oprawę lampy w oświetlaczu;
5) wyjmij kartkę papieru z lustra;
6) zamknąć przysłonę aperturową kondensora. Poruszając zwierciadłem i lekko przesuwając oprawę lampy, obraz żarnika skupia się na przysłonie aperturowej. Odległość oświetlacza od mikroskopu powinna być taka, aby obraz żarnika lampy był równy średnicy przysłony aperturowej kondensora (przesłonę aperturową można obserwować za pomocą płaskiego zwierciadła umieszczonego po prawej stronie podstawy mikroskop).
7) otworzyć przysłonę aperturową kondensora, zmniejszyć otwarcie przysłony polowej oświetlacza i znacząco zmniejszyć natężenie lampy;
8) przy małym powiększeniu (10x) patrząc przez okular uzyskuje się ostry obraz preparatu;
9) poprzez lekkie obrócenie zwierciadła obraz przesłony polowej, który wygląda jak jasna plama, zostaje przeniesiony na środek pola widzenia. Opuszczając i podnosząc kondensor uzyskujemy ostry obraz krawędzi przesłony polowej w płaszczyźnie preparatu (wokół nich może być widoczna kolorowa obwódka);
10) otworzyć przysłonę polową oświetlacza do krawędzi pola widzenia, zwiększyć intensywność żarnika lampy i nieznacznie (o 1/3) zmniejszyć otwarcie przysłony kondensora;
11) Zmieniając soczewki, należy sprawdzić ustawienia światła.
Po zakończeniu regulacji światła Köhlera nie ma możliwości zmiany położenia kondensora oraz otwarcia przysłony polowej i aperturowej. Oświetlenie leku można regulować wyłącznie za pomocą filtrów neutralnych lub zmieniając intensywność lampy za pomocą reostatu. Nadmierne otwarcie przysłony kondensora może spowodować znaczny spadek kontrastu obrazu, a niedostateczne otwarcie może skutkować znacznym pogorszeniem jakości obrazu (pojawienie się pierścieni dyfrakcyjnych). Aby sprawdzić prawidłowość otwarcia przysłony aperturowej należy zdjąć okular i patrząc w tubus otworzyć go tak, aby w jednej trzeciej zakrywał pole świetlne. Aby prawidłowo oświetlić preparat podczas pracy z obiektywami o małym powiększeniu (do 10x), należy odkręcić i zdjąć górną soczewkę kondensora.
Uwaga! Pracując z obiektywami zapewniającymi duże powiększenie - z mocnymi systemami suchymi (40x) i immersyjnymi (90x), aby nie uszkodzić przedniej soczewki, podczas ustawiania ostrości należy stosować następującą technikę: patrząc z boku, opuść obiektyw makro wkręcić prawie do momentu zetknięcia się z preparatem, następnie patrząc w okular za pomocą makrośruby bardzo powoli podnosić soczewkę do momentu pojawienia się obrazu i za pomocą mikrośruby dokonuje się ostatecznego ogniskowania mikroskopu.

Pielęgnacja mikroskopu

Podczas pracy z mikroskopem nie należy używać dużej siły. Nie dotykaj palcami powierzchni soczewek, lusterek i filtrów.
Aby chronić wewnętrzne powierzchnie soczewek, a także pryzmaty tubusu przed kurzem, należy zawsze pozostawić okular w tubusie. Czyszcząc zewnętrzne powierzchnie soczewek, należy usunąć z nich kurz za pomocą miękkiej szczoteczki umytej w eterze. W razie potrzeby dokładnie przetrzyj powierzchnie soczewek dobrze umytą, niezawierającą mydła szmatką lnianą lub batystową, lekko zwilżoną czystą benzyną, eterem lub specjalną mieszanką do czyszczenia optyki. Nie zaleca się przecierania optyki obiektywu ksylenem, gdyż może to spowodować jej rozerwanie.
Z lusterek srebrzonych zewnętrznie kurz można usunąć jedynie poprzez przedmuchanie go gumową gruszką. Nie można ich wytrzeć. Soczewek nie można także samodzielnie odkręcać ani demontować – doprowadzi to do ich uszkodzenia. Po zakończeniu pracy przy mikroskopie należy dokładnie usunąć pozostałości olejku immersyjnego z przedniej soczewki obiektywu, stosując metodę opisaną powyżej. Następnie opuść stolik (lub kondensor w mikroskopach ze stolikiem stałym) i przykryj mikroskop pokrywą.
Aby zachować wygląd mikroskopu należy okresowo przecierać go miękką ściereczką lekko nasączoną w bezkwasowej wazelinie, a następnie suchą, miękką i czystą szmatką.

Oprócz konwencjonalnej mikroskopii świetlnej istnieją metody mikroskopowe, które umożliwiają badanie niewybarwionych mikroorganizmów: kontrast fazowy , ciemne pole I świecący mikroskopia. Do badania mikroorganizmów i ich struktur, których rozmiar jest mniejszy niż rozdzielczość mikroskopu świetlnego, należy użyć

Jakość obrazu określony rozdzielczość mikroskopu, tj. minimalna odległość, z której optyka mikroskopu może oddzielnie rozróżnić dwa blisko siebie położone punkty. rozdzielczość zależy od apertury numerycznej obiektywu, kondensora i długości fali światła oświetlającego preparat. Apertura numeryczna (otwór) zależy od apertury kątowej i współczynnika załamania światła ośrodka znajdującego się pomiędzy przednią soczewką obiektywu i kondensora a preparatem.

Przysłona kątowa obiektywu- jest to maksymalny kąt (AOB), pod jakim promienie przechodzące przez preparat mogą przedostać się do soczewki. Przysłona numeryczna obiektywu równy iloczynowi sinusa połowy apertury kątowej i współczynnika załamania światła ośrodka znajdującego się pomiędzy szkiełkiem a przednią soczewką obiektywu. nie dotyczy = n sinα gdzie, N.A. - apertura numeryczna; n jest współczynnikiem załamania światła ośrodka pomiędzy próbką a soczewką; sinα jest sinusem kąta α równym połowie kąta AOB na schemacie.

Zatem apertura systemów suchych (między przednim obiektywem a przygotowaniem powietrza) nie może być większa niż 1 (zwykle nie większa niż 0,95). Medium umieszczone pomiędzy próbką a obiektywem nazywa się cieczą immersyjną lub immersją, natomiast obiektyw przeznaczony do pracy z cieczą immersyjną nazywa się immersją. Dzięki zanurzeniu o większym współczynniku załamania światła niż powietrze, możliwe jest zwiększenie apertury numerycznej obiektywu, a co za tym idzie, rozdzielczości.

Apertura numeryczna soczewek jest zawsze wygrawerowana na ich oprawkach.
Rozdzielczość mikroskopu zależy również od apertury kondensora. Jeśli uznamy, że apertura kondensora jest równa aperturze obiektywu, to wzór na rozdzielczość ma postać R=λ/2NA, gdzie R jest granicą rozdzielczości; λ - długość fali; N.A. - apertura numeryczna. Ze wzoru wynika, że ​​przy obserwacji w świetle widzialnym (zielona część widma - λ = 550 nm) rozdzielczość (granica rozdzielczości) nie może być > 0,2 µm

Wpływ apertury numerycznej obiektywu mikroskopu na jakość obrazu

Sposoby zwiększania rozdzielczości optycznej

Dobór dużego kąta stożka świetlnego zarówno od strony soczewki, jak i od strony źródła światła. Dzięki temu możliwe jest zebranie większej liczby załamanych promieni światła z bardzo cienkich struktur w obiektywie. Zatem pierwszym sposobem na zwiększenie rozdzielczości jest zastosowanie kondensora, którego apertura numeryczna odpowiada aperturze numerycznej obiektywu.

Druga metoda polega na zastosowaniu płynu immersyjnego pomiędzy przednią soczewkę obiektywu a szkiełko nakrywkowe. W ten sposób wpływamy na współczynnik załamania światła ośrodka n, opisany w pierwszym wzorze. Jego optymalna wartość zalecana dla cieczy zanurzeniowych wynosi 1,51.

Płyny zanurzeniowe

Płyny zanurzeniowe są niezbędne do zwiększenia apertury numerycznej i, w związku z tym, zwiększenia rozdzielczości obiektywów immersyjnych, specjalnie zaprojektowanych do pracy z tymi cieczami i odpowiednio oznakowanych. Ciecze immersyjne umieszczone pomiędzy obiektywem a próbką mają wyższy współczynnik załamania światła niż powietrze. Dzięki temu promienie świetlne odbite od najmniejszych szczegółów obiektu nie są rozpraszane po wyjściu z preparatu i przedostawaniu się do soczewki, co prowadzi do wzrostu rozdzielczości.

Wyróżnia się soczewki immersyjne do wody (oznaczone białym pierścieniem), olejkowe soczewki immersyjne (czarny pierścień), glicerynowe soczewki immersyjne (żółty pierścień) i monobromonaftalenowe soczewki immersyjne (czerwony pierścień). W mikroskopii świetlnej preparatów biologicznych stosuje się obiektywy immersyjne w wodzie i oleju. Specjalne obiektywy immersyjne kwarcowo-glicerolowe przepuszczają krótkofalowe promieniowanie ultrafioletowe i są przeznaczone do mikroskopii ultrafioletowej (nie mylić z fluorescencyjną) (czyli do badania obiektów biologicznych selektywnie pochłaniających promienie ultrafioletowe). Obiektywy zanurzeniowe z monobromowanego naftalenu nie są stosowane w mikroskopii obiektów biologicznych.

Jako płyn immersyjny do soczewki immersyjnej stosuje się wodę destylowaną, a jako płyn immersyjny do soczewki olejowej stosuje się olej naturalny (cedrowy) lub syntetyczny o określonym współczynniku załamania światła.

W odróżnieniu od innych płynów immersyjnych Zanurzenie oleju jest jednorodna, ponieważ ma współczynnik załamania światła równy lub bardzo zbliżony do współczynnika załamania światła szkła. Zazwyczaj ten współczynnik załamania światła (n) jest obliczany dla określonej linii widmowej i określonej temperatury i jest wskazany na butelce z olejem. Przykładowo współczynnik załamania olejku immersyjnego przy pracy z szybą nakrywkową dla linii widmowej D w widmie sodu w temperaturze = 20°C wynosi 1,515 (nD 20 = 1,515), przy pracy bez szkła nakrywkowego (nD 20 = 1,520 ).

Aby pracować z soczewkami apochromatycznymi, normalizowana jest również dyspersja, czyli różnica współczynników załamania światła dla różnych linii widma.

Preferowane jest stosowanie syntetycznego olejku immersyjnego, ponieważ jego parametry są dokładniej ustandaryzowane i w przeciwieństwie do olejku cedrowego nie wysycha na powierzchni przedniej soczewki obiektywu.

Biorąc powyższe pod uwagę, w żadnym wypadku nie należy stosować substytutów olejku imersyjnego, a w szczególności olejku wazelinowego. W niektórych metodach mikroskopowych, aby zwiększyć aperturę kondensatora, pomiędzy kondensatorem a próbką umieszcza się ciecz zanurzeniową (zwykle wodę destylowaną).